1、与耐药机制有关药敏试验与耐药机制有关药敏试验的规范化的规范化 卫生部北京医院卫生部北京医院陈东科陈东科 前言前言w细菌耐药已成为一个全球性问题，已对人类健康构成严重威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机理是当今细菌学的一个最重要的课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。w在细菌耐药机理的检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛应用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。一、革兰阳性球菌耐药机
2、制一、革兰阳性球菌耐药机制 实验室检测项目实验室检测项目w（1）青霉素酶的检测）青霉素酶的检测 w（2）MRS(甲氧西林耐药葡萄球菌甲氧西林耐药葡萄球菌)w（3）VISA/VRSA(万古霉素耐药金黄色葡萄球菌万古霉素耐药金黄色葡萄球菌)w（4）肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药w（5）HLAR(高水平氨基糖苷类耐药高水平氨基糖苷类耐药)w（6）VRE(万古霉素耐药万古霉素耐药肠球菌肠球菌)w（7）PRSP(青霉素耐药肺炎链球菌青霉素耐药肺炎链球菌)w（8）克林霉素诱导试验）克林霉素诱导试验（一）青霉素酶的检测（一）青霉素酶的检测 w检测青霉素酶方法有碘量法、酸量法和显色头
3、孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩（Nitrocefin）作用一定时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。葡萄球菌可诱导葡萄球菌可诱导-内酰胺酶的检测：内酰胺酶的检测：w如果青霉素对葡萄球菌的MIC 0.12g/ml 或者抑菌环直径29 mm，应该对其进行可诱导-内酰胺酶的检测。将待检细菌传代至BAP或者MHA琼脂平板上，用OX或FOX纸片作为诱导剂（具体方法同纸片药敏试验），过夜培养，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。用头孢硝噻吩纸片法（Cefinase）进行测试。测试时用1滴无菌
4、水将Cefinase 纸片湿润，将抑菌圈边缘的受试菌直接涂于经湿润后的Cefinase 纸片，1h内观察其颜色反应，纸片变红色为诱导试验阳性，不变色（黄色）为阴性。可诱导-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。(二二)甲氧西林耐药葡萄球菌（甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS）检测）检测w检测mecA 和其表达的青霉素结合蛋白2a(PBP2a，也称为PBP2)是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确最准确的方法，它也被用于证实证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA 基因或产PBP2a（mecA 基因表达产物）的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林/甲氧西林耐药。不携带m
5、ecA 或不产PBP2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见罕见非mecA 基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC4g/ml，即使mecA 基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。1.苯唑西林纸片筛选试验苯唑西林纸片筛选试验 方法：方法：使用含1g苯唑西林纸片（而不是甲氧西林或萘夫西林）来检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备的接种物（0.5麦氏比浊浓度菌液）接种MH琼脂平板，待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33-35孵育24h，测量抑菌圈直径。结果判断：结果判
6、断：按NCCLS/CLSI解释标准判断结果，金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径10mm为耐药，13mm为敏感。除路邓葡萄球菌外的其它凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径17mm为耐药，18mm为敏感。w注意事项注意事项w（1）在透射光透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如有说明耐药。w（2）试验温度超过35不能检测MRS。w（3）纸片扩散法结果如有疑问有疑问，必须进行mecA 基因或PBP2a 测定、头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS 菌株，选择其中一种试验结果进行报告。2.苯唑西林苯唑西林-盐琼脂筛选试验盐琼脂筛选试
7、验 方法：方法：w 试验用的MH琼脂中含苯唑西林含苯唑西林6g/ml，并添加有氯化钠（4%W/V-0.68 mol/L）。直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度。进行试验时，使用1l 接种环蘸取菌液，在平板上涂成直径10 到15mm 斑点。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区。将琼脂平板置于35，孵育24小时后检查有无细菌生长，任何生长任何生长都表示对苯唑西林耐药（如图）。注意事项：注意事项：为从凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需要将琼脂平板孵育48小时。3.头孢西丁纸片法头孢西丁纸片法 方法：方法：应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用
8、含30g头孢西丁头孢西丁纸片，35孵育24h（如耐药则在孵育18h后可报告结果）。使用反射光反射光阅读头孢西丁纸片试验结果。结果判读：结果判读：头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径21mm时，应报告对苯唑西林耐药，22mm应报告对苯唑西林敏感。除路邓葡萄球菌外凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径24mm时，应报告对苯唑西林耐药，25mm应报告对苯唑西林敏感。w注意事项：注意事项：检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，头孢西丁纸片试验是首选方法首选方法（因为头孢西丁较苯唑西林的敏感性高，如图）。4.mecA 基因及基因及PBP2a 测定测定 方法：方法：可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进
9、行检测（有成品试剂供应）。结果判断：结果判断：mecA 基因或PBP2a（mecA 基因表达产物）检测阳性的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林/甲氧西林耐药耐药。不携带mecA或不产PBP2a 菌株应报告对苯唑西林/甲氧西林敏感敏感。5.苯唑西林苯唑西林MIC 试验试验 方法：方法：可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判读：结果判读：若苯唑西林MIC4g/ml，即使即使mecA 基因和基因和PBP 2a 检测为阴性检测为阴性，也应报苯唑西林耐药（罕见非mecA基因介导的苯唑西林耐药机制）。可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。6.MRS的临床报告：的临床报告：
10、w对于甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS），应报告对所有所有-内酰胺类药物内酰胺类药物耐药，而不考虑不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感。因为大多数文献报告了MRS 感染对-内酰胺类治疗反应差或者因为还没有令人信服的临床数据证实这些药的临床效果。（三）万古霉素耐药葡萄球菌的筛选（三）万古霉素耐药葡萄球菌的筛选 1.纸片筛选法纸片筛选法 方法：方法：应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30g万古霉素万古霉素纸片，352孵育24h。结果判断：结果判断：所有抑菌圈 14mm的葡萄球菌均应用稀释法测其MIC值。注意事项：注意事项：纸片扩散法不能区分万古霉素敏感（MIC 范围0.52g/ml
11、）和万古霉素敏感性减低的菌株（MICs 48g/ml）。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）(MIC16g/ml)，在万古霉素纸片周围仅见轻微生长。用含6g/ml 万古霉素BHI 琼脂筛选平板，可提高检测万古霉素中介（VI）和万古霉素耐药（VR）金黄色葡萄球菌的敏感性。2.琼脂筛选法琼脂筛选法 方法：方法：用含 6g/mL万古霉素万古霉素BHI琼脂琼脂（脑心浸液琼脂）进行筛选试验，直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度。使用微量吸管取菌液10l，点种琼脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，挤去多余菌液，在平板上涂成直径10 到15mm斑点或在部分区域划线接种，35，孵育24h，观察结果。结果判断：
12、结果判断：点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。注意事项：注意事项：用含6g/ml 万古霉素BHI琼脂筛选平板，可提高检测万古霉素中介和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。3.MIC确认试验确认试验 方法：方法：可采用琼脂或肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判断：结果判断：MIC 2g/ml 为敏感，MICs 48g/ml 为敏感性降低（VIS），MIC16g/ml为耐药（VRS）。注意事项：注意事项：任何耐万古霉素葡萄球菌(VISA/VRSA)应送参考实验室进一步确证。（四）肠球菌对青霉素（四）肠球菌对青霉素/氨苄西林耐药性检测氨苄西林耐药性检测 肠球菌对青霉素和氨
13、苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白（PBPs），个个别菌株别菌株是产生-内酰胺酶。纸片扩散法药敏试验可准确测定PBPs改变的菌株，但对产-内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应测-内酰胺酶。（五）高水平氨基糖苷类耐药肠球菌检测（五）高水平氨基糖苷类耐药肠球菌检测 方法：方法：用高浓度庆大霉素（120g）或链霉素（300g）纸片可以筛选出此类耐药性。结果判断：结果判断：无抑菌圈为耐药，抑菌圈直径10mm时表明为非高水平耐药。抑菌圈直径在7-9mm的菌株应使用稀释筛选试验进行检测。对于庆大霉素，稀释法的MIC500g/ml，即为耐药。对于链霉素，微量肉汤稀释法的MIC1000g/ml，琼
14、脂稀释法的MIC2000g/ml，即为耐药。wHLAR的的临床意义：临床意义：对高浓度氨基糖苷类敏感，表示氨基糖苷类与作用于细胞壁的抗菌药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）联合用药时对该肠球菌菌株将具有协同作用，也是敏感的。对氨基糖苷类高水平耐药（HLAR）表明当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果。（六）万古霉素耐药肠球菌的检测（六）万古霉素耐药肠球菌的检测 要想使用纸片扩散法准确检测出耐万古霉素肠球菌(VRE)，需要将平板孵育满孵育满24h（而不是16-18h）,借透射光透射光仔细检查抑菌圈内有无小菌落或弥漫生长。纸片法结果为中介度时应测定MIC值。
15、可采用琼脂或肉汤稀释法或Etest等方法进行MIC检测。筛选试验筛选试验：6g/mL万古霉素万古霉素BHI琼脂琼脂（脑心浸液琼脂）筛选试验，35，孵育24h,点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。（七）（七）青霉素耐药肺炎链球菌的检测青霉素耐药肺炎链球菌的检测 1.肺炎链球菌的耐药机制肺炎链球菌的耐药机制 青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，改变后使PBP（-内酰胺类抗生素的作用靶位）与青霉素的结合力下降，因而导致耐药。2.纸片扩散法检测纸片扩散法检测 方法：方法：使用含1g苯唑西林纸片苯唑西林纸片而不是青霉素纸片，来
16、检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性。培养基：培养基：Mueller-Hinton琼脂+5%羊血。接种物：接种物：直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育：孵育：352；5%CO2；20-24小时。结果判断：结果判断：当苯唑西林抑菌环20mm时可报告肺炎球菌对青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。当苯唑西林的抑菌环19mm 的菌株应当测定青霉素和头孢噻肟或头孢曲松及美洛培南的MICs，因为抑菌环19mm
17、，可以发生在青霉素耐药、中介或敏感的某些菌株中，不能仅仅不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环根据苯唑西林的抑菌环19mm，就报告对青霉素耐，就报告对青霉素耐药或中介。药或中介。3.稀释法检测稀释法检测 用M-H肉汤同时加2%-5%融血的马血做肺炎链球菌的稀释法药敏试验。青霉素的MIC 0.06g/ml 为敏感。（八）诱导性克林霉素耐药检测（八）诱导性克林霉素耐药检测 1.耐药机理：耐药机理：对大环内酯耐药的葡萄球菌（或-溶血链球菌）可能存在有结构性结构性（天然）或诱导性诱导性对克林霉素的耐药 通过erm 基因编码的23S rRNA 甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B 型链阳霉素）耐药，或只对大环
18、内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。2.检测方法：检测方法：w培养基：Mueller-Hinton琼脂+5%羊血w接种物：直接菌悬液法，相当于0.5麦氏标准。w孵育：352；5%CO2；20-24h。w方法：方法：诱导克林霉素耐药可使用“D”抑菌环试验抑菌环试验，纸片边缘相距12mm，可作为正常纸片扩散法一部分，经35孵育24h。w结果判断：结果判断：若靠近红霉素纸片（15g/片）侧克林霉素(2g/片)的抑菌环出现“截平”（称为“D”抑菌环），则菌株存在克林霉素诱导耐药，应报告对“克林霉素耐药”。在报告单中可注明“经诱导克林霉素耐药试验推测此菌株对克林霉素耐药，在某些病人中克林霉素可
19、能仍有效”。若无“截平截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。二、二、-内酰胺酶介导的革兰阴性细菌内酰胺酶介导的革兰阴性细菌耐药机制检测耐药机制检测 革兰阴性细菌对革兰阴性细菌对-内酰胺类抗生素的耐药机制：内酰胺类抗生素的耐药机制：（1）产生-内酰胺酶水解灭活药物；（2）细菌外膜通透性下降；（3）主动泵出药物。其中产生-内酰胺酶是革兰阴性细菌对-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。w临床上重要的-内酰胺酶有以下几种：（1）超广谱）超广谱-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBL）；）；（2）头孢菌素酶（头孢菌素酶（AmpC酶）；酶）；（3）碳青霉烯酶（包括）碳青霉烯酶（包括KPC酶）。酶）。(一一)超广谱超广谱
20、-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBL）的检测）的检测 w1.初筛试验初筛试验 (1)按常规标准纸片扩散法进行操作 对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌：对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌：头孢泊肟抑菌圈直径17mm、头孢他啶22mm、氨曲南27mm、头孢曲松25mm或头孢噻肟27mm。对奇异变形杆菌判断标准：对奇异变形杆菌判断标准：头孢泊肟抑菌圈直径22mm、头孢他啶22mm或头孢噻肟27mm。上述抑菌圈直径（任何一种药物任何一种药物），提示菌株可能产ESBLs。(2)按常规标准肉汤稀释法进行操作 结果判断：头孢他啶、氨曲南、头孢曲松或头孢噻肟等任任何一种何一种药物对大肠埃希菌、肺炎克雷伯
21、菌和产酸克雷伯菌的MIC2.0g/ml，头孢泊肟MIC8.0g/ml，提示菌株可能产ESBLs。对奇异变形杆菌判断标准：头孢泊肟、头孢他啶或头孢噻肟MIC2.0g/ml。w2.双纸片协同法双纸片协同法 w按常规纸片扩散法在MHA上涂布好受试菌，先在琼脂平板中心贴上阿莫西林/克拉维酸(20g/10g)纸片，然后在其上下左右贴30g/片头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南纸片，各纸片中心距复合剂纸片中心距离20-30mm，35，孵育18-20h。结果解释，如周围4个药物纸片中有任何一个任何一个抑菌圈在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强，说明该菌株产ESBLs。w3.表型确证试验表型确证试验 （
22、1）纸片扩散法：）纸片扩散法：使用每片含30g头孢他啶、头孢噻肟纸片和头孢他啶/克拉维酸（30g/10g）、头孢噻肟/克拉维酸（30g/10g）的复合剂纸片进行试验，当任何一种复合剂纸片抑菌圈直径大于（或等于）其单独药敏纸片抑菌圈直径5mm，可确证该菌株产ESBLs。w表型确证试验表型确证试验 （2）琼脂稀释法：）琼脂稀释法：使用头孢他啶(0.25-128g/ml)、头孢他啶/克拉维酸(0.25/4-128/4g/ml)、头孢噻肟(0.25-64g/ml)和头孢噻肟/克拉维酸(0.25/4-64/4g/ml)进行MIC测试，当与克拉维酸联合药物组的MIC小于或等于单独药物组MIC 3个倍比稀释
23、度个倍比稀释度时（8倍浓度倍浓度），可确证该菌株产ESBLs。（二）（二）AmpC酶的检测酶的检测 w对于对于AmpC酶，酶，CLSI目前还没有可供推目前还没有可供推荐的方法进行检测，也没有相应的判断荐的方法进行检测，也没有相应的判断标准。目前用于标准。目前用于AmpC酶定性的检测方酶定性的检测方法很多，主要有以下几种。法很多，主要有以下几种。w1.单纸片扩散法（初筛试验）单纸片扩散法（初筛试验）若抑菌环直径CAZ14mm、CTX14mm、CRO13mm、ATM15mm、CPD14mm、FOX 14mm。且克拉维酸协同或增效试验阴性时可疑为产AmpC酶菌株。w2.双纸片协同法（初筛试验）双纸片
24、协同法（初筛试验）w将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含200g/片片氯唑西林氯唑西林（Cloxacillin,CLO）纸片贴于MH平板中央，于氯唑西林纸片周围分别贴上头孢西丁头孢西丁（FOX）纸片（纸片中心距离15-20mm），置35过夜培养，观察有无协同现象，氯唑西林与头孢西丁有协同现象者可疑为产AmpC酶菌株。3.双纸片增效试验双纸片增效试验 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢西丁/氯唑西林、头孢他啶/氯唑西林、头孢噻肟/氯唑西林、头孢曲松/氯唑西林、氨曲南/氯唑西林、头孢泊肟/氯唑西林、头孢哌酮/氯唑西林纸片，置35过夜
25、培养。与单纸片平皿对照，若加氯唑西林纸片（200g/片片）较未加氯唑西林纸片抑菌环直径5mm（非CLSI标准），且对上述超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）耐药，即为AmpC酶阳性。w4.三维试验法三维试验法（1）三维纸片法（初筛试验）三维纸片法（初筛试验）将0.5麦氏标准浓度的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，贴一片头孢西丁(FOX)纸片于MH平板中央，用无菌纸片沾取待检菌贴在距抗生素纸片5mm处，置35过夜培养。出现失状菌苔失状菌苔者为阳性。三维纸片法不能区分不能区分诱导或持续产酶。（2）三维沟槽法）三维沟槽法w三维（沟槽）实验是目前公认的测定质粒型或去阻遏（持
26、续高产型）AmpC-内酰胺酶的经典方法，是唯一能够鉴别AmpC酶和其它头霉素耐药机理（如外膜通透性降低）的方法。w1）三维）三维沟槽沟槽试验方法试验方法w将0.5麦氏标准浓度的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含30g/片头孢西丁纸片（Cefoxitin,FOX）贴于MH平板中央，分别在距头孢西丁纸片5mm处，挖三个（最多四个）1104mm的槽，槽内分别加入40l AmpC阳性对照菌、ESBLs阳性对照菌及待检菌的粗提酶液粗提酶液，置35过夜培养。w2）三维试验法）三维试验法原理原理 标准大肠杆菌ATCC 25922对头孢西丁是敏感的，平皿上会出现2328mm
27、的抑菌环，AmpC酶对照液加到槽中后，由于AmpC酶扩散到周围琼脂中破坏了头孢西丁(FOX)，因此槽周围会长出细菌，抑菌环缺损，形成一指向FOX的矢状菌苔，即AmpC酶阳性；而头孢西丁（头霉素）不会被ESBL水解，因此ESBL对照槽周围抑菌环是完整的，即AmpC酶阴性；如果待检菌沟槽处出现抑菌环的缺损，即为去阻遏AmpC酶阳性，反之阴性。三维试验法原理加样槽酶扩散区ATCC 25922抑菌环矢状菌苔抗生素纸片 3）去阻遏型（持续型）去阻遏型（持续型）AmpC 酶的确认酶的确认w菌株对超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）耐药；w氯唑西林协同法和增效法阳性；w三维（沟槽）法阳性。符合上述条件的菌株可判
28、定为持续高产AmpC-内酰胺酶株。（三）碳青霉烯酶的测定（三）碳青霉烯酶的测定w碳青霉烯酶碳青霉烯酶:指所有能明显水解亚胺培南或美罗指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类培南等碳青霉烯类抗生素的一类内酰胺酶，分内酰胺酶，分别属于别属于Ambler分子分类中的分子分类中的A类、类、B类、类、D类酶，类酶，包括包括KPC 内酰胺酶和金属酶。内酰胺酶和金属酶。CLSI目前还没目前还没有可供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法，有可供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法，但是但是2009年的年的CLSI文件中（文件中（M100-S19-Appendix G）增加了对）增加了对KPC 内
29、酰胺酶的检测内酰胺酶的检测方法方法(即改良的三维纸片法即改良的三维纸片法-Modified Hodge test)。w用于用于KPC酶定性的检测方法主要有以下几种：酶定性的检测方法主要有以下几种：(1)改良三维试验法；(2)分子生物学方法。w用于金属酶定性的检测方法主要有以下几种：用于金属酶定性的检测方法主要有以下几种：(1)EDTA双纸片协同及增效试验；(2)三维试验法；(3)分子生物学方法。w纸片筛选法：选用厄他培南、美罗培南。亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选药物。w改良Hodge试验是碳青霉烯酶的表型检测方法，用于检测KPC的敏感性及特异性均大于90%，但检测其他碳青霉烯酶时，敏感性及特异性
30、变化较大。1.KPC酶检测酶检测w2001年首次报道从肺炎克雷伯菌中分离到KPC-1，它属于Bush分类法中的A类2f组，克拉维酸对其活性有抑制作用。wKPC 内酰胺酶目前已有内酰胺酶目前已有4种亚型，包括种亚型，包括KPC-1至KPC-4，他们之间只有个别氨基酸发生了突变。在多个菌属中都有报道。主要为质粒介导，但在阴沟肠杆菌中可由染色体介导。w国外报道，产KPC 内酰胺酶菌株即可表现为对碳氢霉烯类抗生素耐药，也可表现为中介或敏感，并存在接种效应（即接种效应（即MIC与细菌的接种菌量成正与细菌的接种菌量成正比比），这就增加了对其识别的难度。质量控制wTest positive and nega
31、tive QC organisms each day of testing.wK.pneumoniae ATCC BAA-1705 modified Hodge test positivewK.pneumoniae ATCC BAA-1706 modified Hodge test negativ2.金属酶金属酶(MBL)测定测定w定义:活性部位带金属离子的酶类称金属-内酰胺酶(Metallo-lactamase,MBL),这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他广谱内酰胺类抗生素。w巯基化合物（巯基化合物（2-2-巯基丙酸）对巯基丙酸）对金属-内酰胺酶的抑制作用强于EDTA，但其毒性作用较
32、强，因此用EDTA进行检测更安全些。（1）双纸片协同法）双纸片协同法 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含10g/片亚胺培南纸片（Imipenem,IPM）贴于MH平板中央，于亚胺培南纸片周围分别贴上EDTA-Na2(K2)（100mmol/L,5l）或巯基化合物（5l）纸片（纸片中心距离为24mm），置35过夜培养，有协同现象者为MBL阳性。金属酶检测结果金属酶检测结果w2-2-巯基丙酸金属酶筛选试验（双纸片法）：巯基丙酸金属酶筛选试验（双纸片法）：A:A:为阴性对照株，未出现协同效应为阴性对照株，未出现协同效应B:B:临床分离株，靠近临床分离株，靠近2-2-巯基丙酸
33、一侧巯基丙酸一侧CAZCAZ抑菌圈明显扩大抑菌圈明显扩大 A B头孢他啶头孢他啶 2-巯基丙酸巯基丙酸 （2）双纸片增效法）双纸片增效法 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴IPM、IPM/EDTA纸片，置35过夜培养。若加EDTA纸片较未加EDTA纸片抑菌环直径5mm（非CLSI标准），且对超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）耐药，即为MBL阳性。w（3）Etest法法 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴一端为IPM 另一端为IPM/EDTA的Etest纸片，置35过夜培养。若加EDTA一端MIC值较未加EDTA一端MIC
34、值低8倍以上，即为MBL阳性。（4）三维试验）三维试验法法w方法：方法：将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含10g/片亚胺培南（IPM）贴于MH平板中央，分别在距亚胺培南纸片边缘5mm处，挖四个110mm的槽，将待检菌的粗提酶液加入槽内,置35过夜培养，观察有无水解现象。w结果观察：槽周围抑菌环是完整的，即MBL阴性；如果待检菌沟槽处出现抑菌环的缺损，即为MBL阳性。（5）酶抑制试验）酶抑制试验w在三维法试验中,以1:10比例将100mmolL-1的酶抑制剂EDTA与待检菌的粗提酶液混匀后加入槽内，置35过夜培养，观察有无抑制现象。如果加ED
35、TA后，酶活性被抑制，即MBL检测阳性。三、三、BLNAR流感嗜血杆菌的检测流感嗜血杆菌的检测w流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制是产生-内酰胺酶，以质粒介导的TEM-1型酶为主，少部分产ROB-1型酶。BLNAR（-lactamase Negative Ampicillin Resistant），意为-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药。BLNAR流感嗜血杆菌的耐药机制主要是由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致。对于BLNAR流感嗜血杆菌的检测，常规实验室一般采用氨苄西林（10 g/片）和阿莫西林/克拉维酸（30 g/片，20/10 g）双纸片结合的方式，如果K-B药敏结果显示氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸均耐药，提示该菌可能为BLNAR流感嗜血杆菌菌株。国外学者Pauliina Krpnoja等研究发现，相对于常规检测方法，低浓度含量的氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸纸片检测BLNAR流感嗜血杆菌菌株的效果可能会更好。
