1、HCV 复制子的研究与应用复制子的研究与应用第三军医大学西南医院感染病分院第三军医大学西南医院感染病分院全军感染病研究所全军感染病研究所王王 小小 红红HCV研究存在的问题研究存在的问题 HCV疫苗研究尚未获得突破进展疫苗研究尚未获得突破进展 急需新型的抗急需新型的抗HCV药物药物 研究主要障碍：研究主要障碍：缺乏合适的细胞模型及小动物模型缺乏合适的细胞模型及小动物模型HCV 细胞模型的发展细胞模型的发展人人T细胞系细胞系：MOLT-4Ma，HPB-Ma，H9，MT-2人骨髓源淋巴样细人骨髓源淋巴样细胞系：胞系：CE，TOFE人人B细胞系细胞系：Daudi原代黑猩猩和人肝原代黑猩猩和人肝细胞细
2、胞WRL68，HepG2非瘤性永生化细胞非瘤性永生化细胞系系：PH5CH，Huh71992年年各种细胞培养系统各种细胞培养系统1994年年肝细胞系肝细胞系1999年年HCV 复制子系统复制子系统1997年年感染性感染性HCV cDNA 克隆分子克隆分子 structuralnonstructural CE1 E2p723 4A4B5A5BRNA binding nucleocapsid Envelope glycoproteins?metallo/Cys-proteinase NTPase/helicase serine proteinaseNS3-prot.cofactor replicat
3、ion?replication interferon resistance RNA-dependent RNA polymerase 191 383 746 809 1026 1657 1711 1972 2419 schematic presentation of the HCV genome 5 3 HCV基因组的异质性基因组的异质性 基因型基因型(Genotype)：1型型,2型型,3型型,4型型,5型型,6型型 亚型亚型(Subtype)：1a,1b,2a,2b,2c,3a等等 50多型多型 准种准种(Quasispecies)：同一个体内存在着：同一个体内存在着一群密切相关但不相同的
4、变异株。一群密切相关但不相同的变异株。Con1HCV 1b型型HCV-N RNA 序列序列其它亚型的扩展其它亚型的扩展Huh-7细胞系，适应性变异细胞系，适应性变异HCV 1a型型H77感染性克隆分子感染性克隆分子Huh-7.5，”curing”细胞克细胞克隆隆HCV 1a型型,2a型型RNA 序列序列HCV复制子复制子(replicon)的发展史的发展史HCV复制子研究中的重要问题复制子研究中的重要问题复制子的构成复制子的构成细胞的容受性细胞的容受性适应性变异适应性变异异源性序列的作用异源性序列的作用完整病毒颗粒的装配完整病毒颗粒的装配Schematic representation of
5、HCV RNAs.The first 21 amino acids of the core coding region(solid box),the gene(Neo,shaded box),the EMCV IRES(EMCV,solid line),H or Con1 indicate H77-or Con1-derived sequences.Blight kj,et al.J Virol,2003细胞的容受性细胞的容受性 Huh-7细胞细胞 不同传代的不同传代的Huh-7细胞容受性有细胞容受性有100多倍的差异多倍的差异 Huh-7.5细胞细胞 “Curing”细胞细胞适应性变异的常见
6、位点适应性变异的常见位点 集中于集中于NS5A富含丝氨酸的中心区域富含丝氨酸的中心区域 NS3解链酶的分子表面解链酶的分子表面 NS4B的两个位点的两个位点 K1846T和和V1897L/M/ALocation of cell culture adaptive mutations and increase of G418 transduction efficiency NS5A:S2204I.NS3:A1226D,P1496LBlight kj,et al.J Virol,200330,000倍倍H/SG-Neo(I)800倍倍H/SG-Neo(I)-7倍倍Con1/SG-Neo(I)-34倍
7、倍Con1/SG-Neo(I)Blight kj,et al.J Virol,2003Effects of cell culture adaptive mutation on infectivity in vivoHCV isolateGenotype Infectivity Replication in cell culture Con-1a1b+/-Con-1/1202+1280+2197b1b-+Con-1/2197c1b+/-+HCV-Nd1b+/-+HCV-H77e1b+-Replication of HCV RNAs with and without heterologous el
8、ements.Blight kj,et al.J Virol,2003表达表达NS3蛋白的蛋白的细胞比例。细胞比例。FSC-H forward scatter FL1-H fluorescenceBlight kj,et al.J Virol,2003HCV复制子研究现状复制子研究现状H77序列复制子能在序列复制子能在Huh-7.5细胞系中复制而不能在细胞系中复制而不能在Huh-7亲代细胞亲代细胞中复制，强调中复制，强调细胞因素对细胞因素对HCV复制的重要性复制的重要性H77序列复制子至少需要两个适应性变异，序列复制子至少需要两个适应性变异，S2204I，A1226D或或 P1496L。Con
9、1复制子共发现复制子共发现4个适应性变异：个适应性变异：R1283G，E1383A，K1609E，K1577R。另有。另有E1202G，T1280I。目前，这。目前，这8个适应性变个适应性变异中有异中有7个位于个位于NS3螺旋酶区域。螺旋酶区域。适应性变异加强适应性变异加强HCV体外复制的机体外复制的机制尚不明了制尚不明了缺乏缺乏neo 及及EMCV IRES的复制子复制效率更高。的复制子复制效率更高。H/E1-P7 H/SG-5 HE H/SG-neo 表明表明EMCV IRES并非并非HCV体外复制及复制酶表达体外复制及复制酶表达所必需所必需不同基因型之间，亚基因组与全基因组的复制效率不一
10、致，不同基因型之间，亚基因组与全基因组的复制效率不一致，Con1全全基因组在基因组在15%Huh-7.5细胞中复制，而亚基因组为细胞中复制，而亚基因组为65%；H77复制子复制子全基因组与亚基因组复制效率是一致的，全基因组与亚基因组复制效率是一致的，15%与与18%。这种差异。这种差异强调强调研究不同基因型复制子的重要性研究不同基因型复制子的重要性迄今，在全基因组复制子研究中，迄今，在全基因组复制子研究中，未见未见HCV颗粒的装配及释放颗粒的装配及释放，其它，其它基因型是否也存在这种现象有待研究基因型是否也存在这种现象有待研究HCV复制子的应用复制子的应用 HCV复制相关基因结构及功能研究复制
11、相关基因结构及功能研究 HCV与宿主细胞间相互作用的研究与宿主细胞间相互作用的研究 抗抗HCV药物的研发及筛选药物的研发及筛选HCV复制相关基因结构的研究复制相关基因结构的研究 发现发现HCV5-UTR在复制及翻译中的作用在复制及翻译中的作用 发现发现HCV3-X尾在复制的作用中尾在复制的作用中 NS5B突变对复制的影响突变对复制的影响The variable region in the 3 NTR enhances RNA replication.(A)Representative result of a transient-replication assay with luciferase
12、 eplicons carrying given engineered restriction sites in the variable region of the 3NTR.(B)Transient replication of luciferase replicons lacking part or the complete variable region(var-9401 and var-9415,respectively).(C)Effects of mutations in the variable region of selectable replicons on the num
13、ber of Geneticin-resistant colonies.Determination of the minimal length of the poly(U/UC)tract required for RNA replication.(A)Result of a transient-replication assay using luciferase replicons that carry a homopolymeric uridine tract of 1,6,26,or 46 nucleotides.(B)Number of Geneticin-resistant colo
14、nies obtained after transfection of selectable replicons with the same modifications in the 3 NTR in panel A.Representative results obtained after transfection of 100 ng of in vitro transcript are shown.(C)Sequence analysis of the poly(U/UC)tracts of replicons isolated from Huh-7 cells that had been
15、 transfected with U6 replicons and subjected to selection with Geneticin.抗病毒药物的筛选抗病毒药物的筛选 包含病毒复制所需关键酶编码基因：包含病毒复制所需关键酶编码基因：Proteinase、NTPase、Helicase、RdRp，潜，潜在的抗病毒靶位在的抗病毒靶位 包含包含5-UTR和和3-UTR：HCVHCV复制翻译的关复制翻译的关键基因键基因 亚基因组复制子能在亚基因组复制子能在Huh7细胞系中稳定高细胞系中稳定高效率复制效率复制Antiviral effects of IFN-,Poly(I)-poly(c),
16、and IFN-a TreatmentFold reductionbGAPDH CtcIFN-(U/ml)0018.01002,30017.61,00023,00017.6Poly(I)-poly(c)(ug/ml)0016.8501.416.5IFN-(U/ml)0015.91002,715.61,00031.915.2a a Replicon lines were treated with IFN-,poly(I)-poly(C),or IFN-for 7 to 9 days.In this experiment,clone 8 cells were treated with IFN-,w
17、hile clone 45 cells were treated with IFN-and poly(I)-poly(C).Treatments were initiated on confluent cultures,and the medium was changed every 2 days.No overt toxicity was observed.b Replicon RNA was quantified by TaqMan RT-PCR,and values are expressed as fold reduction compared to the values for un
18、treated cells.c The TaqMan RT-PCR assay for replicon RNA was multiplexed for the GAPDH mRNA to demonstrate a lack of effect of treatments on cellular mRNA,and all values were normalized for GAPDH.GAPDH values are expressed as Ct,the amplification cycle at which the values exceeded the background threshold.92例患者例患者HCV基因分型系谱图基因分型系谱图92例患者例患者HCV基因型分布图基因型分布图 1b2a3a3b6a1b2a3a3b6a35.9%14.1%14.1%15.2%20.7%33例例13例例13例例14例例19例例引物设计图引物设计图5 UTR5.2kb扩增扩增4.4kb扩增扩增3 UTRHCV 1b 型长链型长链 RT-nested PCR及全长基因组产物电泳图及全长基因组产物电泳图 4.4kb5.2kb9.5kb5.2kb4.4kb9.5kb
