1、血红蛋白的提取和分离 含flash选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。理或化学性质的生物大分子。根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。类的蛋白质。大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡聚糖或（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。琼脂糖）构成的多孔小球体，内部
2、有许多贯穿的通道。根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而相对而相对分子量较大分子量较大的蛋白质无法进入凝的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。速度较快。相对分子质量不同
3、相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分的蛋白质分子因此得以分离。离。分离蛋白质分离蛋白质 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液酸或强碱的影响使原来溶液PHPH值基本保持不变的混值基本保持不变的混合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。通常由通常由1 12 2 种缓冲剂溶解于水种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同同PHPH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。,利用缓
4、冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的血红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能，便于观察，便于观察()和科和科 学研究学研究()磷酸缓冲液磷酸缓冲液带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种
5、分子动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性带电性质质的差异以及的差异以及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不同，使的不同，使带电分子产生不同的带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实现样品中，从而实现样品中各种分子的分离各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。1 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作
6、用下聚合交联成的具有胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDSSDS。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与能与各种蛋白质形成各种蛋白质形成，SDSSDS所带负所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子
7、电荷的量大大超过了蛋白质分子。因而。因而掩盖了掩盖了，使电泳迁移率，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。完全取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离
8、血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤次数不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间低速短时间离心（速度离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤。溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（
9、低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已步骤三次，直至上清液中已没有黄色没有黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。初次离心后的结果3次洗涤后的结果 加蒸馏水到原血液体积，再加加蒸馏水到原血液体积，再加4040体体积的甲苯积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌，置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟（加分钟（加速细胞破裂）速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10 minmin。第第1 1层（最层（最上层）：甲苯层（无色透明）；
10、第上层）：甲苯层（无色透明）；第2 2层层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第薄层固体）；第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。色）。用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。分出下层的红色透明液体。取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml30
11、0ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液中（的磷酸缓冲液中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。利用透析袋透析 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔平。底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖覆盖尼龙网，再用尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端。端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，：底塞中插入的玻璃管
12、的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。A A、材料：交联葡聚糖凝胶（、材料：交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G”G”表示凝胶的交联程度，表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围膨胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水凝胶膨胀时吸水
13、7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：计算并称取配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。A A、固定：将色谱柱装、固定：将色谱柱装置固定在支架上。置固定在支架上。B B、装填：将凝胶悬浮液一次性的、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存、装填凝胶柱时
14、不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果低分离效果。装配好的凝胶柱装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓的磷酸缓冲液（冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平）充分洗涤平衡衡1212小时。小时。1 1、液面不液面不要低于凝胶表面，否则可能要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入有气泡混入，影响液体在柱内，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的流动与最终生物大分子物质的分离效果。的分
15、离效果。2 2、不能发生洗不能发生洗脱液流干，脱液流干，露出凝胶颗粒的现露出凝胶颗粒的现象象。打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。与凝胶面平齐，关闭出口。吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入小心加入pH=7.0
16、pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿
17、管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；样品的纯化；最后经最后经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。
