1、肿瘤精准医疗肿瘤精准医疗之之ctDNActDNA检测检测上海上海交通交通大学附属胸科医院大学附属胸科医院检验科检验科 娄加陶娄加陶E-mail:1血浆是健康的风向标 Diza JCO 2014q自体免疫疾病q肿瘤q器官移植排异q运动（比如马拉松）q孕妇胚胎q急性器官损伤(中风，心肌梗塞，胰腺炎等）Liquid Biopsy四大类四大类CTCcf-DNAct-DNAMicroRNAExosomeProtein/peptides循环肿瘤DNA（ctDNA）MandelMandel等1940s1940s首次报道胞外核酸（cell-free nucleic acids,cfDNA）(1000-2000
2、 copies/ml)ctDNActDNA是由肿瘤细胞释放入血的cfDNAcfDNA（约0.1-1%）读取分析ctDNActDNA携带的信息（突变、表观遗传修饰及完整性），用于筛查、预后和进展判断，寻找干预策略Schwarzenbach H,Nat Rev Cancer,2011Nature ReviewsNature ReviewsCancerNecroptosisApoptosisSecretioncfDNA的特点Taniguchi et.al.,Clin Cancer Res(2011)In-house dataIn-house dataNewmanNewman et.al.,Natet
3、.al.,Nat MedMed (2014)(2014)总量少 1000023(27%)48(56%)5(6%)6(7%)0(0%)3(3%)0(0%)1(1%)片段小 集中在170bp左右800,000600,000400,000200,0000100150200250300MedianFragment length(bp)FrequencyDNA copies/200uL plasma(N=86)Number of samples(%)ctDNActDNA丰度低Fraction of EGFR mutant in total cfDNAFraction of EGFR mutant in
4、total cfDNANumber of EGFR M+Number of EGFR M+plasma samplesplasma samplesactivating mutations,N=32T790M,N=11141210864200.01%-0.1%0.1%-1%1%-10%10%63135736ctDNActDNA的生物学特征的生物学特征携带有肿瘤特异性的遗传学改变:SNV、CNV、InDel、SV显著的片段化特征：166bp实时变化，半衰期短:2h含量低，不同癌症及个体间差异明显代表肿瘤的全局信息:原位+转移6Nature Medicine 20,548554(2014)Cheta
5、n Bettegowda et al.,Sci Transl Med 2014;6:224ra24ctDNActDNA更全面的反应肿瘤更全面的反应肿瘤的分子异质性的分子异质性TumorMetastasMetastasis is Tumor Tumor a single snapshotspatial selection bias ctDNAcfDNAcfDNA的研究历史的研究历史Siravegna and Bardelli Genome Biology 2014,15:449ctDNA多种检测技术Heitzer et al.Clin Chem,2015ctDNActDNA检测方法检测方法10检
6、测内容：浓度浓度/含量含量+肿瘤特异性分子遗传学改变肿瘤特异性分子遗传学改变分类分类基于基于PCRPCR的检测方法的检测方法基于基于NGSNGS的技术的技术特点特点针对少量已知突变靶向多基因的未知遗传学变异举例举例ARMS-PCRTAM-Seqdigital PCRCAPP-SeqBEAMingcSMART敏感性敏感性高低 ctDNA的检测方法ARMS-PCR(super/plus+)ARMS-PCR(super/plus+)11ARMS是目前最为成熟和常用的血液EGFR基因突变检测的方法；优点：检测敏感性高，达1%；缺点：只能检测已知类型突变；随检测位点的增加，非特异性结合概率及对DNA模板
7、量的需求会增加。Digital PCR Digital PCR 12优点优点缺点缺点直接绝对定量目标拷贝数只能针对确定的SNP位点不受扩增效率影响，对PCR抑制物耐受性强每个病人都要设计个性化探针敏感性极高，适合在复杂背景中检测稀有突变可同时检测位点的通量较低 BEAMingBEAMing13Devin Dressman et al.PNAS 2003;100:8817-8822优点：直接准确定量已知位点的突变发生率缺点：需要定制个性化的探针四种不同血浆检测方法的性能比较Kenneth S et al.Lung Cancer,2015,90(3):509-515ARMS ARMS 平台平台数字
8、数字PCRPCR平台平台14靶向深度测序技术杂交法(hybridization based)RNA(Agilent SureSelect)DNA(Roche/NimbleGen EZ SeqCap,IDT xGen LockDown)扩增法(amplification based)AmpliSeq(Thermo/LifeTech)Padlock/MIP/Heat-Seq(Roche)Selector/Haloplex(Agilent)GoldenGate(Illumina)AMP(ArcherDX)RainDanceFluigidm Access ArrayCost,scalability r
9、obustness,batch size,automation,sensitivity,input materials,uniformity,quantification accuracy 控制背景噪音是关键8/6/202217样本准备文库制备NGS测序数据分析2013_NGS-ACMG_GinM杂交法和扩增法对比TAM-SeqTAM-Seq（tagged-amplicon deep sequencingtagged-amplicon deep sequencing）突变频率检出率可达2%敏感性和特异性高于97%Tim Forshew et al.,Sci Transl Med 2012;4:
10、136ra6818ConfidentialCAPP-SeqCAPP-Seqcancer cancer personalized profiling by deep personalized profiling by deep sequencing(COSMIC)sequencing(COSMIC)19Selector Selector 区域：区域：139个基因的521个外显子和13个内含子，约125K，占人基因组的0.004%检出率：检出率：Stage I 检出率50%Stage II-IV 检出率100%NSCLC检出率96%突变检出率0.02%20ConfidentialcSMARTcSM
11、ART技术技术Clinical Chemistry 2015;v.61,p.172-181.优点：操作简单，灵敏度高，可以检测突变和简单的融合模式；缺点：引物设计过于复杂，只能检测有限的几个位点，通量小，应用受限；21 ctDNA ctDNA 检测技术对比检测技术对比检测方法检测方法技术分辨技术分辨率率定量结果定量结果重复性重复性(CV)(CV)*多突变多突变PanelPanel检测检测新发突变新发突变检测检测PCR平台平台ARMS-PCR1/100N/A否否ddPCR1/100020%否否BEAMing1/100020%否否NGS平台平台PCR扩增子测序扩增子测序1/10020%是是捕获测序
12、捕获测序1/500010%是是cSMART1/100005%是是ctDNActDNA的临床应用的临床应用早期筛查早期筛查治疗反应治疗反应评估预后评估预后复发监测复发监测靶向治疗靶向治疗血血ctDNActDNA的含量的含量监测肿瘤负荷及动态发展，微小残余病变、评估疾病预后；监测肿瘤负荷及动态发展，微小残余病变、评估疾病预后；ctDNActDNA的遗传学变异的遗传学变异个体化用药、治疗反应、复发、休眠性克隆等个体化用药、治疗反应、复发、休眠性克隆等23ctDNA:specific aimsTumor genotypingTumor genotyping complementary to tissu
13、e biopsyDetecting minimal residual Detecting minimal residual disease(MRD):disease(MRD):longitudinal trackingResistance surveillanceResistance surveillance:relapse warning,drug selectionPredictive/diagnostic value(+methylation etc.)ctDNActDNA含量检测含量检测预后预后晚期早期残余病变？随后的22个月病人表现出无疾病状态放化疗有效？7个月之后死于NSCLC一个
14、隐匿性的微小病变？残余肿瘤?or 放疗后炎症反应？在接下来随访的21个月里均为无疾病状态随访到35个月均为无疾病状态，治愈25Nature Medicine 21,795-801(2015)ctDNActDNA遗传学变异检测遗传学变异检测实时实时调整个体化用药方案调整个体化用药方案根据ctDNA中KRAS mutation 的浓度调整anti-EGFR 的剂量间歇疗法26ctDNActDNA遗传学变异遗传学变异追踪耐药突变追踪耐药突变Geoffrey R.Oxnard et al.Clin Cancer Res 2014;20:1698-1705 EGFR EGFR敏感性突变敏感性突变 T79
15、0M T790M耐药性突变耐药性突变27Remon J,et al.Future Oncol,2015.NSCLC靶向治疗分子靶点PatientsBiopsy Site 1T790M/Biopsy Site 2T790M/Patient 1 Lung tumorBrain tumorPatient 2 Lung tumorBrain tumorPatient 3Lung tumorCSFPatient 4Pleural effusionCSFPatient 5Pleural effusionCSFPatient 6Pleural effusionCSFPatient 7Pleural effu
16、sionCSFPatient 8Pleural effusionCSFPatient 9Pleural effusionCSFPatient 10Pleural effusionCSFPatient 11Pleural effusionCSFPatient 12Pleural effusionCSFPatient 13Lung tumorCSFPatient 14Lung tumorCSFPatient 15Lung tumorCSFPatient 16Lung tumorCSFPatient 17Pleural effusionCSFPatient 18Pleural effusionCSF
17、Patient 19Pleural effusionCSFPatient 20Pleural effusionCSFPatient 21Pleural effusionCSFPatient 22Clavicular LNCSFPatient 23Lung tumorPleural effusionPatient 24Lung(primary)Lung(meta)Patient 25Lung tumorPleural effusionPatient 26Lung tumorPleural effusionPatient 27Abdominal LNSkin tumorPatient 28Lung
18、 tumorPleural effusionPatient 29Lung tumorClavicular LNPatient 30Lung tumorPericardial effusion 脑部胸部总计+-+202-101020总计121022 一致性一致性 :12/22:12/22（55%55%）其中22例匹配的胸部和脑部标本30位TKI耐药后接受多位点再次活检患者的T790M状态T790M组织检测的空间异质性Akito Hata,et al.JTO,2015 :代表接受TKI治疗；：代表停止TKI治疗A：阿法替尼；III：三代TKI；B：贝伐单抗；H-E：高剂量erlotinib；G：易
19、瑞沙24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均检测T790M突变状态 5位患者停止TKI治疗一段时间后，T790M状态从阳性变成阴性 1位患者在接受高剂量的厄洛替尼后脑脊液的T790M由阴性转阳性T790M组织检测的时间异质性Akito Hata,et al.JTO,2015EGFR基因突变血检共识2014年欧洲药品管理局：当难以获取肿瘤组织样本时，可采集外周血外周血作为补充标本评估EGFR基因突变，以明确吉非替尼治疗中受益的患者2015年NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识：肿瘤组织仍仍是优先选择的生物样本，但难以获取时血液血液可作为合适的替代生物材料WT:1000
20、0MT:10000WT:10000MT:1000WT:10000MT:500WT:10000MT:100WT:10000MT:50WT:10000MT:10WT:10000MT:5WT:10000MT:1数字PCR检测ctDNA T790M突变线性评估将1、5、10、50、100、500、1000、10000个拷贝的含有T790M突变的H1975细胞基因组DNA加入到10000个拷贝的含有野生型EGFR的A549细胞基因组DNA中，根据检测到的突变型拷贝数建立数字PCR拷贝数和突变比例的检测线性范围。数字PCR检测ctDNA T790M突变线性评估Theoretical copies Meas
21、ured copies Expected mutant%Observed mutant%R2=0.9998R2=0.993拷贝数的线拷贝数的线性范围性范围突变比例的线突变比例的线性范围性范围数字PCR检测ctDNA T790M突变空白限设定False positive droplet eventsNormalized countT790MT790M设定为设定为1 100.10.20.30.40.50.60.70.80.90123456789LOBLOB：以泊松分布：以泊松分布95%95%的置信区间的置信区间为上限为上限 利用利用20例健康体检者的例健康体检者的cfDNA进行检测，将进行检测，将
22、泊松分布的泊松分布的95%置信区间上限作为参考置信区间上限作为参考上限，上限，设定设定T790M的空白检出限。的空白检出限。临床应用：比较血液临床应用：比较血液ctDNA突变检测突变检测 Digital PCR vs ARMS突变检出率比突变检出率比较较方法学方法学19-Del（n=23)L858R(n=34)T790M(n=34)血浆血浆EGFR突变检突变检出出ddPCR30%20.6%17.6%ARMS26%8.8%0P值0.740.170.01在在19-Del和和L858R的检出方面，的检出方面，ddPCR和和ARMS无显著差异；在无显著差异；在T790M检出方面，检出方面，ddPCR有明显优势。有明显优势。总结ct-DNA生物学特性ct-DNA检测方法ct-DNA临床运用ct-DNA展望我们工作：平台建设、EGFR突变、NGS3637
