1、第第15章章 色谱分析法基础色谱分析法基础15-1、概述、概述15-2、色谱分析法及其基本概念、色谱分析法及其基本概念色谱法简介、分类、特点，色谱分离过程及相关术色谱法简介、分类、特点，色谱分离过程及相关术语语15-3、色谱分析基本理论、色谱分析基本理论色谱理论基础、分离度及色谱基本分离方程式色谱理论基础、分离度及色谱基本分离方程式15-4、色谱定性和定量分析、色谱定性和定量分析定性分析、定量分析定性分析、定量分析教学目标及要求教学目标及要求 1 1、了解色谱法的分类、特点。、了解色谱法的分类、特点。2 2、掌握色谱分离法基本原理及有关术语的含义和物、掌握色谱分离法基本原理及有关术语的含义和物
2、理意义。理意义。3 3、理解塔板理论、速率理论；掌握分配系数、分配、理解塔板理论、速率理论；掌握分配系数、分配比的物理意义。掌握柱效率的物理意义及其计算方比的物理意义。掌握柱效率的物理意义及其计算方法；理解速率理论方程对色谱分离的指导意义。法；理解速率理论方程对色谱分离的指导意义。4 4、掌握分离度的含义、计算及影响分离度的重要色、掌握分离度的含义、计算及影响分离度的重要色谱参数。谱参数。5 5、掌握色谱定性及定量分析方法。、掌握色谱定性及定量分析方法。经典的分离方法经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取；沉淀、蒸馏和萃取；现代分析中，大量采用现代分析中，大量采用色谱和电泳分离色谱和电泳分离方法。迄
3、方法。迄今为止，今为止，色谱方法是最为有效的现代分离分析手段色谱方法是最为有效的现代分离分析手段！15-1概概 述述 色谱法是一种色谱法是一种物理化学物理化学分离方法。将这种分离方分离方法。将这种分离方法与适当的法与适当的检测手段检测手段相结合，应用于分析化学领域，相结合，应用于分析化学领域，就是色谱分析法。就是色谱分析法。一、色谱法简介一、色谱法简介 1903年，俄国植物学家茨维特年，俄国植物学家茨维特（Mikhail Tswett）最先发明最先发明。在色谱法中，将装填在玻璃或金在色谱法中，将装填在玻璃或金属管内固定不动的物质称为属管内固定不动的物质称为固定相固定相（碳酸钙），在管内自上而下
4、连续（碳酸钙），在管内自上而下连续流动的液体或气体称为流动的液体或气体称为流动相流动相（石（石油醚），装填有固定相的玻璃管或油醚），装填有固定相的玻璃管或金属管称为金属管称为色谱柱色谱柱。15-2色谱分析法及其基本概念色谱分析法及其基本概念 色谱法分离原理：色谱法分离原理：根据混合物中各组分在固定相和流动相中具根据混合物中各组分在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，各组分有不同的分配系数，当两相作相对移动时，各组分在两相间进行反复多次分配，就使性质或结构不同在两相间进行反复多次分配，就使性质或结构不同的各组分产生了明显的分离效果，从而依先后顺序的各组分产生了明显的分离效果，
5、从而依先后顺序流出色谱柱。根据色谱流出曲线给出的各种信息，流出色谱柱。根据色谱流出曲线给出的各种信息，可对各组分进行分析和测定。可对各组分进行分析和测定。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。二、色谱法的分类二、色谱法的分类1、按两相物理状态分类、按两相物理状态分类 1）气相色谱气相色谱：气气固色谱固色谱（GSC）、气、气液色谱液色谱（GLC）2）液相色谱液相色谱：液液固色谱固色谱（LSC）、液、液液色谱液色谱（LLC）3）超临界流体色谱超临界流体色谱2、按固定相的形式分类按固定相的形式分类1）柱色谱柱色谱：填充柱色谱、：填充柱色谱、毛细管柱色谱毛细管柱
6、色谱2）平板色谱平板色谱：薄层色谱、：薄层色谱、纸色谱纸色谱 3、按组份在固定相上的分离机理分类按组份在固定相上的分离机理分类 1）吸附色谱吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；：不同组份在固定相的吸附作用不同；2）分配色谱分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；：不同组份在固定相上的溶解能力不同；3）按其它作用原理按其它作用原理：离子交换色谱、凝胶色谱（尺寸：离子交换色谱、凝胶色谱（尺寸排阻色谱）等。排阻色谱）等。三、色谱法的特点三、色谱法的特点分离效率高分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体（手性异构体）复杂混合物，有机同系物、异构体（手性异构体）2.2.灵敏度高灵敏度高：可以
7、检测出可以检测出1010-11-111010-9-9克的物质，适于作痕量分析。克的物质，适于作痕量分析。需要的样品量极少，一般以微克计，有时仅以纳克计。需要的样品量极少，一般以微克计，有时仅以纳克计。3.3.分析速度快分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一次色谱分一般在几分钟或几十分钟内可以完成一次色谱分析。析。4.4.应用范围广应用范围广：分析有机物、无机物、高分子和生物大分子；分析有机物、无机物、高分子和生物大分子；不仅可以分析气体，也可以分析液体和固体物质。不仅可以分析气体，也可以分析液体和固体物质。不足之处：不足之处：对未知物的定性较为困难。对未知物的定性较为困难。四、色谱图及
8、色谱常用术语四、色谱图及色谱常用术语（一）色谱分离过程（一）色谱分离过程混合组分的分离过程混合组分的分离过程及检测器对各组份在及检测器对各组份在不同阶段的响应不同阶段的响应 色谱过程是多组分混合物在流动相带动下通色谱过程是多组分混合物在流动相带动下通过色谱固定相，实现各组分分离的。过色谱固定相，实现各组分分离的。基本特点：基本特点：1、混合物中不同组分在柱内产生、混合物中不同组分在柱内产生差速迁移差速迁移提提供了实现分离的可能性。供了实现分离的可能性。2、同种组分分子沿柱子的、同种组分分子沿柱子的扩散分布扩散分布（开始时的一（开始时的一条很窄的线逐渐展宽）条很窄的线逐渐展宽）不利于实现不同组分
9、之不利于实现不同组分之间的分离。间的分离。（二）色谱常用术语（二）色谱常用术语 检测器响应信号随时间变化的微分曲线，即色检测器响应信号随时间变化的微分曲线，即色谱流出曲线，也称色谱图谱流出曲线，也称色谱图。1、色谱峰、色谱峰：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。2、基线、基线：在正常操作条件下，色谱柱后没有组分进：在正常操作条件下，色谱柱后没有组分进入检测器时，检测器的响应信号随时间变化的曲线入检测器时，检测器的响应信号随时间变化的曲线称为基线。稳定的基线为水平直线。图中称
10、为基线。稳定的基线为水平直线。图中CD所示。所示。3、峰高：、峰高：色谱峰顶点与基线的距离。以色谱峰顶点与基线的距离。以h表示，图表示，图中中AB。标准偏差标准偏差：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半倍峰高处色谱峰宽度的一半，图中，图中EF的一半的一半。半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽，图中峰高一半处的峰宽，图中GH。W1/2=2.354 峰底宽峰底宽Wb：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离，图中距离，图中IJ。Wb=4 4、区域宽度：、区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：下
11、的动力学因素。通常有三种表示方法：0tLu 死时间死时间柱长柱长1）死时间死时间t0：不被固定相吸附或溶解的组分（如空气、：不被固定相吸附或溶解的组分（如空气、甲烷）从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间，图甲烷）从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间，图中中OA所示。所示。t0也是也是流动相流经色谱柱所需的时间流动相流经色谱柱所需的时间。据据 t0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 5、保留值、保留值R：是试样各组分在色谱柱中保留行为是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，它的量度，它反映组分与固定相间作用力大小反映组分与固定相间作用力大小，通，通常用保留时间和保留体积表示。它是色谱定性分
12、常用保留时间和保留体积表示。它是色谱定性分析和色谱过程热力学特性的重要参数。析和色谱过程热力学特性的重要参数。3）调整保留时间调整保留时间 t R：扣除死时间后的保留时间，它：扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。图中是组分在固定相中的滞留时间。图中AB所示，即所示，即t R=tR tO t R 反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物理化学基础。消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物理化学基础。2)保留时间保留时间tR：指某组分通过色谱柱所需时间，即试：指某组分通过色谱柱所需时间，即试样从进样到出现
13、峰极大值时的时间，图中样从进样到出现峰极大值时的时间，图中所示。所示。在一定色谱体系和操作条件下，任何一种化合物在一定色谱体系和操作条件下，任何一种化合物都有一个确定的保留时间，这是色谱定性的依据。都有一个确定的保留时间，这是色谱定性的依据。4）死体积死体积V0：色谱柱内载气所占的体积。色谱柱内载气所占的体积。其中，其中，Fco为柱出口的载气流速为柱出口的载气流速（mL/min)。5）保留体积保留体积VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。极大点时所通过的流动相的体积。6）调整保留体积调整保留体积 V R：扣除死体积后的保留体积。：扣除
14、死体积后的保留体积。coRRFtVcoRRRFtVVV0co00FtV 7）相对保留值相对保留值r2,1：组份：组份2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1的的调整保留值之比。调整保留值之比。注意：注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其谱分析中，尤其是是GC中广泛用于定性的依据中广泛用于定性的依据！121212121,2RRRRRRRRVVttVVttr色谱流出曲线的意义（色谱流出曲线的意义（重要信息重要信息）：）：色谱峰数样品中单组份的最少个
15、数；色谱峰数样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价色谱柱分离效能评价指标；指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的固定相或流动相选择是否合适的依据。依据。6、描述分配过程的参数、描述分配过程的参数（1）分配系数分配系数(Distribution constant,K)：描述组分在固定相和流动相间的分配过程或描述组分在固定相和流动相间的分配过程或吸附吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。脱附过程的参数，称为分配系数。mscc组分在流动相中的浓度组分在固定
16、相中的浓度K K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。特性和所用仪器无关。K值表明了组分与固定相间作用力的大小值表明了组分与固定相间作用力的大小。K值值大，说明组分与固定相的亲和力大，即组分在柱中大，说明组分与固定相的亲和力大，即组分在柱中滞留的时间长，移动速度慢。滞留的时间长，移动速度慢。（2）分配比分配比(Retention factor or capacity factor,k)：在一定温度和压力下，组分在两相间的分配在一定温度和压力下，组分在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。达平衡时，分配在固定相和流动相中
17、的质量比。它它反映了组分在柱中的迁移速率反映了组分在柱中的迁移速率。其中其中Vm V0，Vs 为固定相体积。为固定相体积。mmssmsVcVcmmk 组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量 k是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。某组分的要参数。某组分的k值可由实验测得值可由实验测得，它等于该，它等于该组分的调整保留时间与死时间的比值组分的调整保留时间与死时间的比值，即，即)1(00000kttVVtttttkRRRR或3.K 与与 k 的关系：的关系：称为相比称为相比，它也是，它也是反映色谱柱柱型及其结构反映
18、色谱柱柱型及其结构的重要特性的重要特性。对填充柱，。对填充柱，=635；对毛细管柱，；对毛细管柱，=501500。kVVkV/mV/mccKsmmmssmsmsVVK1Kk即：注意：注意：K 或或 k 反映的是某一组分在两相间的分配，它反映的是某一组分在两相间的分配，它们都与组分及两相的性质有关，并随柱温、柱压的们都与组分及两相的性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化。变化而变化。K与两相体积无关与两相体积无关，而，而k则随固定相的则随固定相的量而改变量而改变，k值越大，组分分配在固定相中的量越值越大，组分分配在固定相中的量越多（保留时间越长），相当于柱的容量越大，因此多（保留时间越长），相当于
19、柱的容量越大，因此k又称容量因子又称容量因子。15-3色谱分析的基本理论色谱分析的基本理论 基本要求：基本要求：实现混合物中各组分的分离。实现混合物中各组分的分离。基本理论：基本理论：1）各组分在两相间的分配情况（两组分峰间距足）各组分在两相间的分配情况（两组分峰间距足够远）：由各组份在两相间的分配系数决定够远）：由各组份在两相间的分配系数决定色色谱过程的谱过程的热力学热力学性质决定。性质决定。2）各组分在色谱柱中的运动情况（每个组分峰宽）各组分在色谱柱中的运动情况（每个组分峰宽足够小）：由组分在色谱柱中的传质和扩散决定足够小）：由组分在色谱柱中的传质和扩散决定色谱过程色谱过程动力学动力学性质
20、决定。性质决定。一、基本理论一、基本理论1.塔板理论塔板理论（Plate theory)1952年，年，Martin等人提出。等人提出。用塔板概念来描述组分在柱中用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏塔中借的分配行为。塔板是从精馏塔中借用的，是一种半经验理论，但它成用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。布。根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算算塔板数塔板数n的公式，用以的公式，用以评价一根柱子的柱效评价一根柱子的柱效。理论塔板数理论塔板数：可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。可见理论
21、塔板数由组分保留值和峰宽决定。若柱长为若柱长为L，则每块理论塔板高度，则每块理论塔板高度H为为 由上述两式知道，由上述两式知道，理论塔板数理论塔板数n越多、理论塔越多、理论塔板高度板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高越小、色谱峰越窄，则柱效越高。222/1)(16)(54.5bRRWtWtnnLH 但上述两式包含死时间但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以通常以有效塔板数有效塔板数neff 和有效塔板高度和有效塔板高度Heff 表示表示：effeffbRReffnLHWtWtn222/1
22、)(16)(54.5有关塔板理论的说明：有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。命。3）塔板理论）塔板理论（意义）把色谱柱看成一个精馏塔，借用（意义）把色谱柱看成一个精馏塔，借用精馏塔中精馏塔中“塔板塔板”概念来描述组分在柱内的分配平衡和概念来描述组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线分离过程、导出
23、流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。2.速率理论速率理论（Rate theory）1956年，荷兰化学工程师年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱提出了色谱过程动力学速率理论。过程动力学速率理论。van Deemter方程：方程：u 为流动相线速度；为流动相线速度；A，B，C为常数，其中为常数，其中A涡流扩散系数；涡流扩散系数；B分子扩散系数；分子扩散系数；C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）该式从动力学角度很好地
24、解释了影响板高（柱效）的各种因素！的各种因素！CuuBAH 1）涡流扩散项）涡流扩散项A A=2 dpdp填充物平均颗粒直径；填充物平均颗粒直径；填充不规则因子。填充不规则因子。可见，可见，固定相颗粒越小固定相颗粒越小dp，填，填充的越均匀，充的越均匀，A，H，柱效，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰比较窄峰变宽现象减轻，色谱峰比较窄。对于空心毛细管柱，无涡流扩对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即散，即A=0。流动方向流动方向2）分子扩散项）分子扩散项 B/u (Longitudinal diffusion term)B=2 D 弯曲因子，它表示柱
25、填充物对分子扩散的阻碍情况弯曲因子，它表示柱填充物对分子扩散的阻碍情况D组分在流动相中的扩散系数。组分在流动相中的扩散系数。讨论：讨论：q流动相分子量大流动相分子量大，Dg小，即小，即B小小q Dg 随随柱温降低柱温降低而减小，随而减小，随柱压降低（短柱）柱压降低（短柱）而减小而减小q u 增加增加，组分停留时间短，纵向扩散小；，组分停留时间短，纵向扩散小；(B/u)q 对于液相色谱，因对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可勿略。项可勿略。)/1(流动相MDg3）传质阻力项）传质阻力项 Cu(Mass-transfer term)a）气液色谱）气液色谱：包括气相传质阻力系数：包括气相传质阻
26、力系数Cs和液相传质和液相传质阻力系数阻力系数ClDd)k1(k32Dd)k1(k01.0CCCl2f2g2p22lg 固液界面固液界面流动相流动相固定液固定液组分分子组分分子ClCg讨论：讨论：F 减小填充颗粒减小填充颗粒直径直径dp；F 用用分子量小的流动相分子量小的流动相，使，使Dg增加；增加；F 减小液膜厚度减小液膜厚度df，Cl下降。下降。F 增加柱温，可增加增加柱温，可增加Dl，但，但k值也减小，值也减小，为保持合适为保持合适Cl值，应值，应控制柱温控制柱温。b）液液色谱）液液色谱：包括流动相传质阻力系数：包括流动相传质阻力系数Cm和固定相和固定相传质阻力系数传质阻力系数Cs。s2
27、fsm2psmmsmDdDd)(CCC sm讨论：讨论：v 流动相传质阻力包括：流动相中的传质阻力流动相传质阻力包括：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力滞留的流动相传质阻力Csm。分别与填充物大小。分别与填充物大小 dp、扩散系数扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。、微孔大小及其数量等有关。降低方法降低方法：细颗粒细颗粒、孔径大的固定相孔径大的固定相、增加组分、增加组分在流动相中的扩散系数在流动相中的扩散系数Dm、粘度低的流动相粘度低的流动相、短柱短柱v 固定相传质阻力与液膜厚度固定相传质阻力与液膜厚度df、容量因子、容量因子 k 和扩散和扩散系数系数Ds等有关。等有关。降低方
28、法降低方法：与气液色谱中的表述相同。：与气液色谱中的表述相同。4）流速）流速u 由由van Deemter方程方程 H=A+B/u+Cu知道：知道：当当u一定时，仅在一定时，仅在A、B、C 较小时，较小时，H 较小，柱较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。以以u 对对H 作图，可得作图，可得H-u 曲线（如图），从该曲曲线（如图），从该曲线得到：线得到：板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/uH=A+B/u+CuCBuCuBdudHopt02BCAH2min 涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；低流速区低流速区
29、（u小），小），B/u大，分子扩散项占主导，大，分子扩散项占主导，应应选择分子量大的气体如选择分子量大的气体如N2和和Ar为载气为载气，可减小扩散系，可减小扩散系数，提高柱效；数，提高柱效；高流速区高流速区（u大），大），Cu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导，应应选择分子量小的气体如选择分子量小的气体如H2和和He为载气为载气，可增加扩散系，可增加扩散系数，提高柱效；数，提高柱效；曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt（）下的）下的最小板高最小板高Hmin（）；）；LC 的的Hmin 和和uopt 均比均比GC 的小一个数量级，即在的小一个数量级，即在LC 中，较低
30、流速可获得较大的柱效。中，较低流速可获得较大的柱效。BC2A C/B 速率理论速率理论是在塔板理论的基础上，把色谱分配是在塔板理论的基础上，把色谱分配过程与组分在两相中的扩散和传质过程相联系，提过程与组分在两相中的扩散和传质过程相联系，提出色谱峰受涡流扩散、分子扩散和传质阻力等因素出色谱峰受涡流扩散、分子扩散和传质阻力等因素控制，控制，从动力学基础上较好解释影响板高的各种因从动力学基础上较好解释影响板高的各种因素，对选择合适的色谱分离条件具有指导意义素，对选择合适的色谱分离条件具有指导意义。它。它比较全面地概括了柱填充物颗粒度，填充均匀性，比较全面地概括了柱填充物颗粒度，填充均匀性，固定液液膜
31、厚度，载气种类及流速等对柱效能和色固定液液膜厚度，载气种类及流速等对柱效能和色谱峰变宽的影响。谱峰变宽的影响。二、分离度及色谱基本分离方程式二、分离度及色谱基本分离方程式（一）分离度（一）分离度R(Resolution)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标。也称总分离效能指标。R定义为相邻两组分色谱峰保定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比，即，即利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。R 越大，相邻组分分离越好越大，
32、相邻组分分离越好。当。当R=1.5 时，分离程时，分离程度可达度可达99.7%，因此，因此R=1.5 通常用作是否分开的判据通常用作是否分开的判据。21122112)(2)(21bbRRbbRRWWttWWttR（二）色谱基本分离方程式（二）色谱基本分离方程式 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设相差小，可合理假设k1 k2=k，Wb1 Wb2。因此可导。因此可导出出R与与n（neff）、）、r2，1和和 k 的关系：的关系：1,21,214rrnReff)1()1(41,21,2kkrrnR或：附：具体推导过程如下：附：具体
33、推导过程如下：2122122112)(21bRRbRRbbRRWttWttWWttR（带入上式得）222224)(16ReffbbRefftnWWtn1,21,2212144rrntttnReffRRReff2)1(kknneff又)1()1(41,21,2kkrrnR有关色谱基本方程式的讨论：有关色谱基本方程式的讨论：1）分离度）分离度R与柱效的关系与柱效的关系 由色谱基本方程式可得：由色谱基本方程式可得：可通过增加柱长提高可通过增加柱长提高R。但分析时间也相应增加，。但分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！且峰宽也展宽！为提高柱效为提高柱效，用，用减小塔板高度减小塔板高度H的方法的方法比增加柱
34、长更有效。比增加柱长更有效。2121221)(LLnnRR2）分离度）分离度R与选择性与选择性r2,1 值的关系值的关系 r2,1 越大，柱选择性越好，对分离有利。越大，柱选择性越好，对分离有利。r2,1 的微的微小变化可引起小变化可引起 R 较大改变。较大改变。改变改变r2,1的方法：的方法：降低柱温、改变流动相及固定相的降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成性质和组成。3）分离度）分离度R分配比分配比k的关系的关系 k，R，但当，但当k10，则，则R的增加不明显。通常的增加不明显。通常k 在在210。改变改变k 的方法：的方法：增加柱温增加柱温(GC)、流动相性质和组、流动相性质和组成成
35、(LC)以及固定相含量以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂(流动相流动相)组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响1：9,10-蒽醌；蒽醌；2：2-甲基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌蒽醌4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成 使 k 最佳色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出现
36、其它待测物的分离不令人满意！实际得到好的分离，但同时出现其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗和梯度淋洗（LC）来解决这个问题。来解决这个问题。概念、表示方法及计算公式汇总概念、表示方法及计算公式汇总参参 数数 符符 号号 测定或计算测定或计算 死时间死时间(迁移时间迁移时间)，不参，不参与分配组分与分配组分 0t 色色谱谱图图 保留时间，组分保留时间，组分1 和和 2 R2R1t，t 色色谱谱图图 调整保留时间，组分调整保留时间，组分 1 R 1t 0tttR1R1 峰宽，组分峰宽，组分1和和 2 Wb1 1，Wb2 色色谱谱图图 柱长柱长 L
37、 直接直接测测量量 流速流速 Fco 直接直接测测量量 流流(固固)定相体积定相体积 Vm，Vs 填填充充制制备备 记录记录 流流(固固)定相浓度定相浓度 cm，c s 分析分析和和制制备备记录记录 参参 数数 符符 号号 测定或计算测定或计算 线速线速 u 流动相体积流动相体积 mV 分配比分配比 分配系数分配系数 选择因子选择因子 分离度分离度 有效塔板数有效塔板数 有效板高有效板高 121,2RRttr2112)(2bbRRWWttR1,21,214rrnReffeffeffbReffnLHWtn2)(1621,21,22)1(16rrRneff1,2r0tLu coomFtV000tt
38、tttkRRmSmmSSVVKVcVckmSmmmSccK kVVkKSm一、定性分析一、定性分析 确定试样中的各组分，即每个色谱峰各代表的何确定试样中的各组分，即每个色谱峰各代表的何种化合物。种化合物。保留值保留值定性的依据定性的依据。1、用已知物对照定性、用已知物对照定性 在一定操作条件下，各组分保留时间是一定值。在一定操作条件下，各组分保留时间是一定值。1）利用保留时间定性）利用保留时间定性 分别以试样和标准物进样，分析各自的色谱图；对照分别以试样和标准物进样，分析各自的色谱图；对照2）利用峰高增量定性）利用峰高增量定性 通过在样品中加入标准物，看试样中哪个峰增加来确定通过在样品中加入标
39、准物，看试样中哪个峰增加来确定15-4 色谱定性和定量分析色谱定性和定量分析2.根据经验式定性根据经验式定性1）碳数规律）碳数规律：在一定温度下，同系物的调整保留：在一定温度下，同系物的调整保留时间时间tR的对数与分子中碳数的对数与分子中碳数n成正比：成正比：lgtR=An+C (n 3)2）沸点规律）沸点规律：同族具相同碳数的异构物，其调整：同族具相同碳数的异构物，其调整保留时间保留时间tR 的对数与分子中沸点的对数与分子中沸点Tb成正比：成正比：lg tR=ATb+C3.根据相对保留值根据相对保留值 ri,s 定性定性 在样品和标准中分别加入同一种基准物在样品和标准中分别加入同一种基准物
40、s，将样品的将样品的ri,s和标准物的和标准物的ri,s 相比较来确定样品中是相比较来确定样品中是否含有否含有 i 组分。组分。只要固定相性质与柱温确定，相只要固定相性质与柱温确定，相对保留值就是一个定值。对保留值就是一个定值。4.保留指数（保留指数（Kovats指数）定性指数）定性 该指数该指数定性的重现性最佳定性的重现性最佳，当固定液和柱温，当固定液和柱温一定时，定性可不需要标准物。它是一定时，定性可不需要标准物。它是把物质的保把物质的保留行为用两个靠近它的基准物来标定得到的留行为用两个靠近它的基准物来标定得到的。设正构烷烃的设正构烷烃的Kovats指数为碳数指数为碳数 100。测定时，将
41、。测定时，将碳数为碳数为n 和和n+1的正构烷烃加入到样品的正构烷烃加入到样品 x 中进行色谱中进行色谱分析，此时测得这三个物质的调整保留值分别为：分析，此时测得这三个物质的调整保留值分别为：tR(Cn)tR(x)tR(Cn+1)利用此式求出未知物利用此式求出未知物Kovats指数指数Ix，然后与文献，然后与文献值对照。值对照。)(lg)(lg)(lg)(lg1001nRnRnRRxCtCtCtxtnI正构烷烃碳数调整保留时间 tr,min2,2-二甲基丁烷苯甲苯Kovats指数的计算图示指数的计算图示(Squalane,60oC)5.双柱或多柱定性双柱或多柱定性 可克服在一根柱上，不同物质可
42、能出现相同可克服在一根柱上，不同物质可能出现相同的保留时间的情况。的保留时间的情况。6.与其它方法结合定性与其它方法结合定性 如如GC-MS，GC-IR二、二、定量分析定量分析 是根据检测器对待测物的响应是根据检测器对待测物的响应（峰高或峰面（峰高或峰面积）与待测物的量成正比积）与待测物的量成正比的原理进行定量的。的原理进行定量的。1.峰面积峰面积A的测量的测量：对称峰对称峰：峰高：峰高h与半峰宽的积：与半峰宽的积：A=1.065 h W1/2不对称峰不对称峰：峰高与平均峰宽的积：峰高与平均峰宽的积：A=1/2 h (W0.15+W0.85)2.定量校正因子定量校正因子1）绝对校正因子）绝对校
43、正因子mi=fi Ai 或或 fi=mi/Ai 通过此式可得到待测物单位峰面积对应的该通过此式可得到待测物单位峰面积对应的该物质的量。物质的量。2）相对校正因子）相对校正因子fi 当用质量当用质量m、摩尔、摩尔M、和气体体积、和气体体积V作计量单作计量单位时，则分别表示为质量校正因子位时，则分别表示为质量校正因子fi(m)、摩尔校正、摩尔校正因子因子fi(M)和体积校正因子和体积校正因子fi(V)：)M(f)V(f)V(f)V(fMM)m(f)M(f)M(f)M(fmAmA)m(f)m(f)m(fisiiisisiisiissii 3）相对校正因子的测量相对校正因子的测量 准确称取被测物与标准
44、物，混合后进样。从准确称取被测物与标准物，混合后进样。从所得色谱图分别求出它们的峰面积，然后通过前述所得色谱图分别求出它们的峰面积，然后通过前述公式计算校正因子（省去公式计算校正因子（省去“相对相对”二字）。二字）。必须注意：必须注意：校正因子只与试样、标准物和检测器类型有关，校正因子只与试样、标准物和检测器类型有关，与其它所有条件无关！可以查表得到。与其它所有条件无关！可以查表得到。3.定量计方法定量计方法1）归一化法）归一化法 把所有出峰组分的含量之和按把所有出峰组分的含量之和按100计的定量方法。计的定量方法。fi 为为i 物质的相对定量校正因子；物质的相对定量校正因子；Ai 为其峰面积
45、。为其峰面积。%100%1002211nniiiiiiiAfAfAfAfAfmm特点及要求特点及要求：简便、准确简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影对测定结果影响不大响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况仅适用于试样中所有组分全出峰的情况，在使用，在使用中受到限制中受到限制。2）内标法：）内标法：是在一定量试样中准确加入一定量的内标物，是在一定量试样中准确加入一定量的内标物，根据待测组分和内标物的峰面积及内标物质量计算根据待测组分和内标物的峰面积及内标物质量计算待测组分质量的方法。待测组分质量的方法。一般常将内标物作测定相对定量校正因子的一般
46、常将内标物作测定相对定量校正因子的基准物，则基准物，则fs=1，使计算简化。使计算简化。试试100100mAfmAfmmAfAfmmsssiiiiissiisi对内标物的要求对内标物的要求：样品中不含内标物；无反应；：样品中不含内标物；无反应；与各待测物保留时间和浓度相差不大；与各待测物保留时间和浓度相差不大；特点特点：准确性较高准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动，操作条件和进样量的稍许变动对定对定量结果的影响不大量结果的影响不大。每个试样的分析，都要进行两次称量，每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大不适合大批量试样的快速分析批量试样的快速分析。3）外标法：）外标法：或标准曲线法。以
47、或标准曲线法。以Ai对对i作图得标准曲线。作图得标准曲线。特点：特点：该法不需校正因子。但进样量和操作条件必须该法不需校正因子。但进样量和操作条件必须严格控制严格控制！外标法！外标法适于日常分析和大批量同类样品适于日常分析和大批量同类样品分析分析。本本 章章 小小 结结 色谱法是一种分离分析技术，其原理是根据混色谱法是一种分离分析技术，其原理是根据混合物中各组分在固定相和流动相中具有不同的分配合物中各组分在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，各组分在两相中反复系数，当两相作相对移动时，各组分在两相中反复多次分配，产生明显的分离效果，从而依次洗出色多次分配，产生明显的分离效果
48、，从而依次洗出色谱柱。根据色谱流出曲线给出的各种信息，可对各谱柱。根据色谱流出曲线给出的各种信息，可对各组分进行分析和测定。组分进行分析和测定。色谱法进行分离的理论依据是塔板理论和速率色谱法进行分离的理论依据是塔板理论和速率理论。塔板理论描述了组分在色谱柱中的分配行为，理论。塔板理论描述了组分在色谱柱中的分配行为，提出用提出用neff 和和Heff 来评价色谱柱的分离效能，即来评价色谱柱的分离效能，即 222/1)(16)(54.5bRReffeffWtWtHLn 速率理论是在塔板理论的基础上，把色谱分配速率理论是在塔板理论的基础上，把色谱分配过程与组分在两相中的扩散和传质过程相联系，用过程与
49、组分在两相中的扩散和传质过程相联系，用速率理论方程式较完善地解释了影响塔板高度的各速率理论方程式较完善地解释了影响塔板高度的各种因素，即种因素，即 H=A+B/u+Cu 为了更全面、真实地反映相邻两组分在色谱柱为了更全面、真实地反映相邻两组分在色谱柱中的分离情况，提出了用分离度中的分离情况，提出了用分离度R作为色谱柱总分作为色谱柱总分离效能指标，即离效能指标，即 由于由于R既反映了两组分保留值的差异，即固定既反映了两组分保留值的差异，即固定液对两组分的选择性，又考虑到色谱峰宽度对分离液对两组分的选择性，又考虑到色谱峰宽度对分离的影响，即柱效能的影响，即柱效能neff 的高低，由此导出色谱基本的
50、高低，由此导出色谱基本分离方程式：分离方程式：21122112)(2)(21bbRRbbRRWWttWWttR 色谱基本分离方程式将分离度及与柱效能色谱基本分离方程式将分离度及与柱效能neff、柱选择性柱选择性r2,1 联系起来，为色谱分离条件的选择提供联系起来，为色谱分离条件的选择提供了理论依据。了理论依据。色谱定性分析方法主要根据保留值与已知物对色谱定性分析方法主要根据保留值与已知物对照定性，利用保留值经验规律定性和根据文献保留照定性，利用保留值经验规律定性和根据文献保留数据定性。数据定性。色谱定量分析方法主要采用归一化法、内标法色谱定量分析方法主要采用归一化法、内标法和标准曲线法。和标准
