1、第六章第六章分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)。DNA在某在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程谓之的过程谓之。变性。变性DNA的单链重新合成双链的过的单链重新合成双链的过程为程为。分子杂交是分子杂交是在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在单链分子放在同一溶液中，或把同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，只要在放在一起，
2、只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的的单链分子之间有一定的碱基配对碱基配对关系，就可以在不关系，就可以在不同的分子之间形成同的分子之间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。DNA的变性的变性(denaturation)定义：定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解开双链解开成两条单链的过程。成两条单链的过程。本质：只改变二级结构，不改变核苷酸排列本质：只改变二级结构，不改变核苷酸排列方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变
3、化：变性后其它理化性质变化：OD260增高增高粘度下降粘度下降比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失目目 录录DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，使其溶液使其溶液OD260增高，并与解链程度有一定的比例关系的现增高，并与解链程度有一定的比例关系的现象。象。目目 录录热变性热变性解链曲线：解链曲线：如果在如果在连续加热
4、连续加热DNADNA的过程中以的过程中以温度对温度对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线得的曲线称为解链曲线。目目 录录 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成。变性是在一个相当窄的温度范围内完成。在在DNA变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%（一半）（一半）时的温度称为时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度的解链温度，又称融解温度(melting temperature,Tm)。其大小与。其大小
5、与G+C含量成正比。含量成正比。G、C含量越高，含量越高，Tm越大；越大；DNA越长，越长，Tm越大；溶液的越大；溶液的离子强度增高，离子强度增高，Tm增加。增加。在在Tm时，有一半的时，有一半的DNA双链被打开双链被打开DNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。减色效应减色效应DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即
6、可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。目目 录录变性和复性的应用：核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)在在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类变性后的复性过程中，如果将不同种类的的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成可以在不同的分子间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可
7、以在不同的DNA与与DNA之间形之间形成，也可以在成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。复性复性RNADNA 核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度温度 离子强度离子强度 杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应非特异性杂交反应*一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的末端或全链的，与固定在，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断
8、是否有同源的核酸分子存膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。在。DNA探针探针通常为通常为400500个碱基，在探个碱基，在探针标记过程中可调整针标记过程中可调整DNA探针的长度。探针的长度。RNA探针探针的长度的长度 相对就不那么易控制相对就不那么易控制 探针太短，可与多个位点杂交降低特异性探针太短，可与多个位点杂交降低特异性探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。F=(1/4)L 2NF值：探针和靶序列杂交的可能频率值：探针和靶序列杂交的可能频率L：探针的核苷酸数目（长度）：探针的核苷酸数目（长度）N：靶序列的复杂性：靶序列的复杂性DNA和和R
9、NA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针 可准确定量，灵敏度高可检测固相介质可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上上10fg(10-15g)的的DNA 本底低，易除去旧探针重新杂交新探针本底低，易除去旧探针重新杂交新探针 特异性高特异性高,对杂交无影响对杂交无影响放射性标记放射性标记-应用最多的一类应用最多的一类优点优点缺点缺点 短半衰期的探针要求临时制备短半衰期的探针要求临时制备,随用随标随用随标 放射性递减使探针降解放射性递减使探针降解 放射性对人体有害放射性对人体有害,需防护需防护 费用贵费用贵 无放射性，对人体的危害小无放射性，对人体的危害小 探针性质稳定，可供长时间内持续使用探针性质稳定，
10、可供长时间内持续使用 检测过程快，可同时进行不同标记探针检测过程快，可同时进行不同标记探针的杂交的杂交 本底较低本底较低 非放射性标记非放射性标记优点优点缺点缺点 灵敏度和特异性不如放射性探针灵敏度和特异性不如放射性探针 杂交条件受到报告基团的限制杂交条件受到报告基团的限制 重新杂交新探针较困难重新杂交新探针较困难 生物素生物素 地高辛地高辛 荧光素：荧光素：FITC，罗丹明，罗丹明 化学发光物：如化学发光物：如ECL 光密度或电子密度标记物光密度或电子密度标记物 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)非放射性标记物种类非放射性标记物种类（一）（一）DNA印迹技术
11、印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究用于蛋白质定性定量及相互作用研究。（四）（四）其他其他分子杂交实验分子杂交实验目目 录录 1975年，英国年，英国Southern创建创建Southern 杂交杂交(Southern bloting)的主要步骤的主要步骤 待测待测DNA样品的制备、酶切
12、样品的制备、酶切 待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性 Southern转膜：转膜：硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备探针的制备 Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测Southern印迹杂交法印迹杂交法M1 210SSC 转移缓冲液转移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因D
13、NA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜(二二)Northern 印迹杂交印迹杂交(Northern bloting)Northern印迹杂交RNARNA的提取的提取由于由于RNase具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止RNase对对RNA的降解作用。细胞裂解液的降解作用。细胞裂解液可以抑制此酶活性。可以抑制此酶活性。RNARNA变性电泳变性电泳电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使二级结构解体，才能使RNA严格按相
14、对分子质量大小分离。变性剂还可促进严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。与硝酸纤维素膜结合。印迹转移印迹转移若待测的若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡中浸泡20 min min，以水解成较小的片段，再用以水解成较小的片段，再用20 xSSC浸泡浸泡45 min min，以加快，以加快RNA的印迹转移。的印迹转移。预杂交预杂交杂交杂交洗膜洗膜放射自显影或化学显色放射自显影或化学显色Western印迹杂交三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较放放射射自自显显影影照照片片目目 录录DNA点阵点阵目目 录录D
15、NA芯片芯片(DNA chip)cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)目目 录录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)
