1、 Protein Biosynthesis(Translation)蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成(翻译)蛋白质的生物合成过程就是将蛋白质的生物合成过程就是将mRNA分子中由分子中由碱基序列碱基序列组成的遗传组成的遗传信息，通过信息，通过遗传密码遗传密码破译的方式转变破译的方式转变成为蛋白质中的成为蛋白质中的氨基酸排列顺序氨基酸排列顺序，因，因而称为翻译（而称为翻译（translation)。DNA复制复制RNA转录转录翻译翻译蛋白质多肽链蛋白质多肽链靶向运输靶向运输折叠折叠遗传信息的传递过程遗传信息的传递过程逆转录逆转录如何证明三个碱基决定一个氨基酸？如何证明三个碱基决定一个氨基酸？htt
2、p:/biowiki.ucdavis.edu/Genetics/Unit_III%3A_The_Pathway_of_Gene_Expression/13%3A_Genetic_code 第一节第一节蛋白质合成体系蛋白质合成体系Protein Biosynthesis System l 20种氨基酸作为原料种氨基酸作为原料l 酶及蛋白因子，如酶及蛋白因子，如IF、eIF等等l ATP、GTP、无机离子、无机离子参与蛋白质生物合成的物质包括：参与蛋白质生物合成的物质包括：l 三种三种RNA mRNA rRNA tRNA真核细胞内真核细胞内RNA的种类及功能的种类及功能细胞定位细胞定位英文缩写英文
3、缩写分子大小及沉降系数分子大小及沉降系数功能功能 胞浆胞浆mRNA100010,000个核苷酸个核苷酸 蛋白质合成蛋白质合成模板模板 胞浆胞浆tRNA74-95个核苷酸个核苷酸转运氨基酸转运氨基酸与密码子识别与密码子识别 胞浆胞浆rRNA28S，5400个核苷酸个核苷酸18S，2100个核苷酸个核苷酸5.8S，160个核苷酸个核苷酸5S，120个核苷酸个核苷酸构成核糖体构成核糖体，蛋白质合成场蛋白质合成场所所S：沉降系数（1S=10-13秒）碱基数量：bp,Kb,Mb原核生物16S rRNA的二级结构 1961年，年，Nirenberg 证明了证明了mRNA的模板作用。的模板作用。一、翻译模板
4、一、翻译模板mRNA及遗传密码及遗传密码细菌矾土颗粒细菌矾土颗粒轻轻研磨轻轻研磨细菌液细菌液离心，去除细胞壁和膜离心，去除细胞壁和膜提取液（提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖体、酶、离子）核糖体、酶、离子）DNA水解酶，水解酶，20种氨基酸等种氨基酸等蛋白质蛋白质DNase蛋蛋白白质质合合成成量量时间时间 mRNA mRNA是遗传信息的携带者是遗传信息的携带者 遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子顺反子（cistroncistron）。）。原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的位，转录生成的mR
5、NAmRNA可编码几种功能相关的可编码几种功能相关的蛋白质，为蛋白质，为多顺反子多顺反子（polycistronpolycistron）。）。真核生物一个真核生物一个mRNAmRNA只编码一种蛋白质，为只编码一种蛋白质，为单单顺反子顺反子（single cistronsingle cistron）。）。5335YAZ乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型53mRNA转录转录翻译翻译多顺反子多顺反子mRNA结构简图结构简图l mRNA上存在遗传密码上存在遗传密码mRNA分子上从分子上从5 至至3 方向，由方向，由AUG开开始，每始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或
6、蛋白质合成的起始、终止信号，个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为称为三联体密码（三联体密码（triplet codon）。）。53m7GpppAAAAn3非翻译区5非翻译区编码区AUGUAAORF从从mRNA 5 端起始密码子端起始密码子AUG到到3 端终端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一条多肽链，称为码连续排列编码一条多肽链，称为开放阅读开放阅读框架框架(open reading frame,ORF)。保温保温蛋白质合成停止蛋白质合成停止poly U，ATP，GTP，氨基酸，氨基酸多聚苯丙氨酸（多聚苯丙氨酸（UUU是是Phe
7、的密码子）的密码子）同样方法证明了同样方法证明了CCC是是Pro的密码子，的密码子，AAA是是Lys的密码子。的密码子。提取液（提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖、核糖 体、酶、离子）体、酶、离子）遗传密码的破译遗传密码的破译遗遗传传密密码码表表密密码码子子的的第第一一个个字字母母密码子的第二个字母密码子的第二个字母密码总数：密码总数：61个编码个编码20种氨基酸种氨基酸 起始密码（起始密码（initiation coden):第一个第一个AUG AUG 意义：编码甲硫氨酸，意义：编码甲硫氨酸，原核生物为甲酰化甲硫氨酸原核生物为甲酰化甲硫氨酸特殊密码：特殊密码：(special code
8、n)UAA、UAG、UGA（赭石）（赭石）（琥珀）（乳白石）（琥珀）（乳白石）终止密码（终止密码（terminatiom coden）1.连续性（连续性（commaless）l遗传密码的特点遗传密码的特点编码蛋白质氨基酸序列的各个三编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间隔联体密码连续阅读，密码间既无间隔也无重叠。也无重叠。重叠密码重叠密码非重叠非重叠连续的连续的密码密码不连续的密码不连续的密码基因损伤引起基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。由于对由于对
9、mRNA外显子的加工，造成外显子的加工，造成mRNA与其与其DNA模板序列之间不匹配，模板序列之间不匹配，使同一使同一mRNA前体翻译出序列、功能不同前体翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（编辑（mRNA editing)。mRNA编辑编辑2.简并性（简并性（degeneracy）遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有仅有一个密码子外，其余氨基酸有24个或多至个或多至6个密码子为之编码。个密码子为之编码。遗传密码的简并性遗传密码的简并性密码子简并性的生物学意义：减少有密码子
10、简并性的生物学意义：减少有害突变。害突变。遗传密码的特异性主要取决于前两位遗传密码的特异性主要取决于前两位碱基。碱基。GCU ACUGCC ACCGCA ACAGCG ACG AlaThr遗传密码的偏爱性遗传密码的偏爱性（bias or preference)多数氨基酸有一个以上的密码子但多数氨基酸有一个以上的密码子但这些密码子使用的频率各不相同，称这些密码子使用的频率各不相同，称之遗传密码的偏爱性。之遗传密码的偏爱性。密码子使用的频率与细胞内相应的密码子使用的频率与细胞内相应的tRNA含量有关含量有关3.通用性（通用性（universal）蛋白质生物合成的整套密码，从原核生蛋白质生物合成的整
11、套密码，从原核生物到人类都通用。物到人类都通用。有少数例外，如动物细胞的线粒体、植有少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。物细胞的叶绿体。密码的通用性进一步证明各种生物进化密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。自同一祖先。4.摆动性（摆动性（wobble）tRNA上反密码子的上反密码子的第第1位位碱基与碱基与mRNA密码子的密码子的第第3位位碱基配对时，可以碱基配对时，可以在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为配对规律，这一现象称为摆动性摆动性。摆动配对摆动配对U 二、核蛋白体是多肽链合成的装置二、核蛋白体是多肽链合成的
12、装置 核蛋白体的组成核蛋白体的组成核蛋核蛋白体白体原核生物原核生物真核生物真核生物蛋白质蛋白质 S S值值 rRNArRNA 蛋白质蛋白质S S值值rRNArRNA小亚基小亚基2121种种30S30S16S16S3333种种40S40S18S18S大亚基大亚基3434种种50S50S23S23S5S5S4949种种60S60S28S28S5.8S5.8S5S5S核蛋白核蛋白体体70S70S80S80S原核生物核蛋白体结构模式原核生物核蛋白体结构模式 30S小亚基：有小亚基：有mRNA结合位点结合位点50S大亚基：大亚基：E位：排出位（位：排出位（Exit site）转肽酶活性转肽酶活性大小亚基
13、共同组成：大小亚基共同组成：A位：氨基酰位位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位位：肽酰位(peptidyl site)三、三、tRNA与氨基酸的活化与氨基酸的活化反密码环反密码环氨基酸臂氨基酸臂tRNAtRNA在翻译过程在翻译过程中起中起接合体接合体（adaptoradaptor）作用，又是作用，又是氨基酸的运氨基酸的运载体。载体。tRNAtRNA的三级结构示意图的三级结构示意图氨基酸氨基酸+tRNA氨基酰氨基酰-tRNAATP AMPPPi氨基酰氨基酰-tRNA合成酶合成酶（一）氨基酰（一）氨基酰-tRNA合成酶合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase)
14、l 氨基酸的活化氨基酸的活化第一步反应第一步反应氨基酸氨基酸ATPE 氨基酰氨基酰-AMP-EAMP PPi第二步反应第二步反应氨基酰氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰氨基酰-tRNA AMP E 氨基酰氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸和合成酶对氨基酸和tRNA都有高度都有高度特异性。特异性。氨基酰氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性合成酶具有校正活性(proof-reading activity)。氨基酰氨基酰-tRNA的表示方法：的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet 氨基酸的活化形式：氨基酸的活化形式：氨基酰氨基酰tRNAtRNA氨基酸的活化部位：
15、氨基酸的活化部位：羧基羧基氨基酸与氨基酸与tRNAtRNA连接方式：连接方式：酯键酯键氨基酸活化耗能：氨基酸活化耗能：2 2个个PP真核生物：真核生物：Met-tRNAiMet原核生物：原核生物：fMet-tRNAifMet（二）起始肽链合成的氨基酰（二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA fMet-tRNAifMet的生成的生成：Met-tRNAifMetfMet-tRNAifMet转甲酰基酶N10-CHO FH4 第二节第二节蛋白质生物合成过程蛋白质生物合成过程The Process of Protein Biosynthesis蛋白质合成中蛋白质合成中mRNA模板的方向：模板的方向：5 3；
16、蛋白质的合成方向：蛋白质的合成方向：N端端 C端。端。蛋白质合成过程：蛋白质合成过程：起始起始延长延长终止终止一、肽链合成起始一、肽链合成起始指指mRNA和起始氨基酰和起始氨基酰-tRNA分别分别与核蛋白体结合而形成与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物翻译起始复合物(translational initiation complex)。参与起始过程的蛋白质因子称起始参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（因子（initiation factor，IF）。）。参与起始过程的蛋白质因子称起始因参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（子（initiation factor，IF）。原核生物起）。原核生物起始因子
17、有三种：始因子有三种：IF-1：占据：占据A位防止结合其他位防止结合其他tRNA。IF-2：促进起始：促进起始tRNA与小亚基结合。与小亚基结合。IF-3：促进大小亚基分离，提高：促进大小亚基分离，提高P位对位对结合起始结合起始tRNA敏感性。敏感性。（一）原核生物翻译起始复合物形成（一）原核生物翻译起始复合物形成核蛋白体大小亚基分离；核蛋白体大小亚基分离；mRNA在小亚基定位结合；在小亚基定位结合；起始氨基酰起始氨基酰-tRNA的结合；的结合；核蛋白体大亚基结合。核蛋白体大亚基结合。IF-3IF-11.核蛋白体大小亚基分离核蛋白体大小亚基分离A U G53IF-3IF-12.mRNA在小亚基
18、定位结合在小亚基定位结合S-D序列：序列：在原核生物在原核生物mRNA起始密码起始密码AUG上上游，存在游，存在49个富含嘌呤碱的一致性序列，个富含嘌呤碱的一致性序列，如如-AGGAGG-，称为，称为S-D序列。又称为核序列。又称为核蛋白体结合位点（蛋白体结合位点（ribosomal binding site，RBS)S-D序列序列 IF-3IF-1IF-2GTPA U G533.起始氨基酰起始氨基酰tRNA与小亚基结合与小亚基结合IF-3IF-1IF-2GTPGDPPiA U G534.核蛋白体大亚基结合核蛋白体大亚基结合IF-3IF-1A U G53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi
19、起始过程消耗起始过程消耗1个个GTP。（二）真核生物翻译起始复合物形成（二）真核生物翻译起始复合物形成核蛋白体大小亚基分离；核蛋白体大小亚基分离；起始氨基酰起始氨基酰-tRNA-tRNA结合；结合；mRNAmRNA在核蛋白体小亚基就位；在核蛋白体小亚基就位；核蛋白体大亚基结合。核蛋白体大亚基结合。真核生物翻译起始因子真核生物翻译起始因子 起始因子起始因子生物功能生物功能eIF-2促进起始促进起始tRNA与小亚基结合与小亚基结合eIF-2B,eIF-3 促进大小亚基分离促进大小亚基分离eIF-4AeIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA结合小亚基结合小
20、亚基eIF-4B促进促进mRNA扫描定位起始扫描定位起始AUGeIF-4EeIF-4F复合物成分，结合复合物成分，结合mRNA 5帽子帽子eIF-4GeIF-4F复合物成分，结合复合物成分，结合eIF-4E和和PABeIF-5促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基大亚基eIF-6促进核蛋白体分离成大小亚基促进核蛋白体分离成大小亚基mRNA eIF-6 GDP+PielF-5ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PAB真核生物翻译起始真核生物翻译起始复合物形成过程复合物形成过程Met-tRNAiMet-elF-2-GTP 真
21、核生物翻译起始的特点真核生物翻译起始的特点 核蛋白体是核蛋白体是80S；起始因子种类多；起始因子种类多；起始起始tRNA的的Met不需甲酰化；不需甲酰化；mRNA的的5帽子和帽子和3poly A尾结构与尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关；在核蛋白体就位有关；起始起始tRNA先与核蛋白体小亚基结合，然先与核蛋白体小亚基结合，然后再结合后再结合mRNA二、肽链的延长二、肽链的延长指按照指按照mRNA密码序列的指导，依密码序列的指导，依次添加氨基酸次添加氨基酸从从N端向端向C端端延伸肽链，直延伸肽链，直到合成终止的过程。到合成终止的过程。肽链的延长是在核蛋白体上连续性循环式肽链的延长是在核蛋白体上连
22、续性循环式进行，又称为核蛋白体循环（进行，又称为核蛋白体循环（ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，分为，每次循环增加一个氨基酸，分为以下三步：以下三步：进位进位（entrance）成肽成肽（peptide bond formation）转位转位（translocation）原核延原核延长因子长因子生物功能生物功能对应真核对应真核延长因子延长因子EF-Tu促进氨基酰促进氨基酰-tRNA进入进入A位，位，结合分解结合分解GTPEF-1-EF-Ts调节亚基调节亚基EF-1-EFG有转位酶活性，促进有转位酶活性，促进mRNA-肽酰肽酰-tRNA由由A位前移到位前移到P位，位，促进
23、卸载促进卸载tRNA释放释放EF-2肽链合成的延长因子肽链合成的延长因子 （一）进位（一）进位指根据指根据mRNA下一组遗传密码指下一组遗传密码指导，使相应氨基酰导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白进入核蛋白体体A位。位。延长因子延长因子EF-T催化催化进位（原核生物）进位（原核生物）Tu TsGTPGDPA U G53TuTsGTP（二）成肽（二）成肽是由转肽酶（是由转肽酶（transpeptidase）催化的肽）催化的肽键形成过程。键形成过程。（三）转位（三）转位延长因子延长因子EF-G有转位酶有转位酶（translocase）活性，可结合并水解）活性，可结合并水解1分分子子GTP，促进核
24、蛋白体向，促进核蛋白体向mRNA的的3侧移动。侧移动。fMetA U G53fMetTuGTP进进位位转转位位成肽成肽真核生物肽链合成的延长过程与原核真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。子。另外，真核细胞核蛋白体没有另外，真核细胞核蛋白体没有E E位，转位，转位时卸载的位时卸载的tRNAtRNA直接从直接从P P位脱落。位脱落。（四）真核生物延长过程（四）真核生物延长过程 三、肽链合成的终止三、肽链合成的终止当当mRNA上终止密码出现后，多肽链上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出
25、，中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。为肽链合成终止。终止相关的蛋白因子称为释放因子终止相关的蛋白因子称为释放因子(release factor,RF)识别终止密码，如识别终止密码，如RF-1特异识别特异识别UAA、UAG；而而RF-2可识别可识别UAA、UGA。诱导转肽酶改变为酯酶活性，使肽链从核蛋诱导转肽酶改变为酯酶活性，使肽链从核蛋白体上释放。白体上释放。释放因子的功能释放因子的功能原核生物释放因子：原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：真核生物释放因子：eRF 原原核核肽肽链链合合成成终终止止过过程程 U
26、A G53RFCOO-原核生物蛋白质合成的原核生物蛋白质合成的能量计算能量计算氨基酸活化：氨基酸活化：2个个PATP起始：起始：1个个GTP延长：延长：2个个GTP终止：终止：1个个GTP结论：结论：每合成一个肽键至少消耗每合成一个肽键至少消耗4个个P。原核生物与真核生物蛋白质合成过程的异同相同点：遗传密码：相同蛋白质合成方向：沿mRNA 5 3方向翻译，肽 链合成方向是N C氨基酸活化：氨基酸需要先活化成氨基酰-tRNA 后参与蛋白质的合成能量消耗：都需要消耗大量ATP多聚核蛋白体：都存在，使蛋白合成快速高效原核生物与真核生物蛋白质合成过程的异同 原核生物 真核生物 模板：mRNA不需要加工
27、，半衰期短，mRNA需要加工，半衰期长 1-3分钟 数小时-十几小时转录与翻译：偶联 不偶联翻译过程：起始：SD序列，fMet-tRNAifmet 5-CBP，Met-tRNAiMet，IF eIF 延长：EF eEF 终止：RFs eRF翻译产物：由多顺反子mRNA翻译成多个 由单顺反子mRNA翻译成一 多肽链 条多肽链不同点：多聚核蛋白体多聚核蛋白体（polysome)一个一个mRNA分子可分子可同时有多个核蛋白体在同时有多个核蛋白体在进行同一种蛋白质的合进行同一种蛋白质的合成，这种成，这种mRNA和多个和多个核蛋白体的聚合物称为核蛋白体的聚合物称为多聚核蛋白体。多聚核蛋白体。电镜下的多聚
28、核蛋白体现象电镜下的多聚核蛋白体现象目目 录录mRNA核糖体DNA53 PABCD多聚核蛋白体产生多聚核蛋白体产生Directed by Gabriel Weiss.One of the strangest,fun,and perhaps most unforgettable films in the science genre was this,produced by University of California at San Diego chemistry professor Kent Wilson,and choreographed by Weiss future wife and
29、1969 Americas Junior Miss,Jackie Benington.After a short description of the interaction between“stars”30s Ribosome,mRNA,and Initiator Factor One by Stanfords Nobel Prize-winning Paul Berg,the camera moves to an open field at Stanford University,where 200 students,fortified by complimentary wine,begi
30、n a Bacchanalian dance replicating the process of protein formation by RNA molecules that carry the DNA code.Benington kept some degree of order by making sure that each string of processes was led by a student in the advanced modern dance program at he university,but clearly the dancers are barely
31、controlled,spurred on the by a free-music band of musicians,who,clearly inspired by their philosophical and geographical proximity to the Haight-Ashbury and the Merry Pranksters La Honda,perform a raucous piece called the Protein Jive Sutra.The film is,in addition to being a superior example of affe
32、ctive filmmaking,a landmark film defining the early 1970s San Francisco Bay Area art,performance,and alternative lifestyles culture.Director Gabriel Weiss,a multifaceted individual who eventually became a doctor of internal medicine and led a twenty-piece jazz band,stated thirty years later that per
33、haps the most satisfying element about the film is how well the biological model presented in the film held up over the ensuing years.Protein Synthesis:an Epic on the Cellular Level(1971)四四.蛋白质生物合成的调节蛋白质生物合成的调节（一）阅读框架的漂移、重叠和（一）阅读框架的漂移、重叠和1.基因重叠调节：基因重叠调节：同一DNA序列以不同的框架阅读方式编码不同种类的蛋白质病毒基因组中重叠基因 BA基因重叠基因
34、重叠A蛋白质蛋白质B蛋白质蛋白质转录翻译mRNA53532.5-AUG的作用起始密码起始密码AUG上游的非编码区也有一个或数个上游的非编码区也有一个或数个AUG称称5 AUG,。从非编码区第一个从非编码区第一个5 AUG开始翻译很快就会遇开始翻译很快就会遇到终止密码子到终止密码子,翻译的产物为无活性的短肽翻译的产物为无活性的短肽,减少正常减少正常AUG的翻译启动作用的翻译启动作用,从而抑制正常翻译的频率从而抑制正常翻译的频率.对翻对翻译起始的竞争译起始的竞争.AUGCAAGCCGGU53编码区正常翻译正常翻译5 AUG竞争正常起始密码翻译AUGCAAGCCGGU53AUGAAAAUGAG编码区
35、编码区非编码区（二）翻译错误校正（二）翻译错误校正.tRNA与密码子反向互补配对，以上是遗传信息正确解读的保障.氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸与tRNA特异选择性（三）5帽和polyA尾2.polyA位点的数目，有或无对形成不同类型的翻译产物具有重要的调节意义1.5帽和polyA尾具有保护mRNA维持 其稳定,保证翻译过程的稳定.降钙素基因降钙素基因降钙素35P 12345含有剪含有剪切位点序列切位点序列TTATTTmRNApolyA1 2 3 1 2 3 4 5 polyA降钙素基因相关多肽降钙素基因相关多肽polyA的调节的调节蛋白质合成后加工和输送蛋白质合成后加工和输送Posttrans
36、lational Processing&Protein Transportation第第 三三 节节从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。主要包括主要包括 多肽链折叠为天然的三维结构多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰肽链一级结构的修饰 高级结构修饰高级结构修饰 疯牛病和疯牛病和“克雅氏症克雅氏症 1.1.1986,England1986,England首次发现。首次发现。2.2.朊病毒蛋白（朊病毒蛋白（
37、prion prion relative relative protein,PrPprotein,PrPc c）是存在于神经原、神经胶质细胞等多种细胞的是存在于神经原、神经胶质细胞等多种细胞的 细胞膜上的糖蛋白。细胞膜上的糖蛋白。Chr20，3335 kD。3.3.PrPPrPc c的空间构象异常改变的空间构象异常改变一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质 新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后进新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后进行，新生肽链行，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延链的折叠即开始。可能随着
38、序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模体、结构域到形成完整的空间构象。模体、结构域到形成完整的空间构象。大多数天然蛋白质折叠都需要其他酶和蛋大多数天然蛋白质折叠都需要其他酶和蛋白质的辅助。白质的辅助。几种有促进蛋白折叠功能的大分子几种有促进蛋白折叠功能的大分子1.分子伴侣分子伴侣(molecular chaperon)2.蛋白二硫键异构酶蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)3.肽肽-脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI)（1）热
39、休克蛋白）热休克蛋白(heat shock protein,HSP)HSP70、HSP40和和GreE族族 （2）伴侣素）伴侣素(chaperonins)GroEL和和GroES家族家族1.分子伴侣分子伴侣分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。的正确折叠。热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：结合保护待折叠多肽片段，再释放该片结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次和多肽片段依次
40、结合、解离的循环。结合、解离的循环。HSP40结合待结合待折叠多肽片段折叠多肽片段 HSP70-ATP复合物复合物 HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物多肽复合物 ATP水解水解GrpE ATPADP复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠 伴侣素的主要作用伴侣素的主要作用:为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。成天然空间构象的微环境。伴侣素系统促进蛋白质折叠过程伴侣素系统促进蛋白质折叠过程 2.蛋白二硫键异构酶（蛋白二硫键异构酶（PDI）二硫键异构酶在内质网腔活性很高，二硫键异构酶在内质网腔活性很高，
41、可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。成热力学最稳定的天然构象。3.肽肽-脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶 多肽链中肽酰多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。种异构体，空间构象明显差别。肽酰肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。异构体之间的转换。肽酰肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构
42、型时，可成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。二、一级结构的修饰二、一级结构的修饰（一）肽链（一）肽链N端的修饰端的修饰（二）个别氨基酸的修饰（二）个别氨基酸的修饰（三）多肽链的水解修饰（三）多肽链的水解修饰（二）个别氨基酸的的共价修饰糖基化羟基化甲基化磷酸化乙酰化亲脂化N-连接糖蛋白的形成 O 型 A 型 B 型 糖链与ABO血型 GlcNAc：Gal：Glc：GalNAc：Fuc：免疫球蛋白分子免疫球蛋白分子IgG的糖链结构的糖链结构 正常糖链 IgG异常糖链 IgG1异常糖链 IgG0 亲脂化：疏水脂链的连接亲脂
43、化：疏水脂链的连接Ras蛋白脂肪酸链Ras蛋白Ras蛋白鸦片促黑皮质素原鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰的水解修饰NC信号肽信号肽PMOCKRKR103肽肽(？)ACTH-LT-MSH-MSHEndophin胰岛素原的C肽切除胰岛素的水解加工过程-非功能片段的切除2.3.内含肽的切除内含肽的切除 内含子 外显子内含肽（intein）：前体蛋白的肽链切除的一些氨 基酸序列。外显肽（extein）：内含肽两侧的氨基酸序列，在 内含肽切除后重新连接起来成 为成熟的蛋白质产物。内含肽剪接是自我催化，机制不详。三、高级结构的修饰三、高级结构的修饰（一）亚基聚合（一）亚基聚合 （二）辅基连接（二）辅
44、基连接（三）疏水脂链的共价连接（三）疏水脂链的共价连接 蛋白质翻译后修饰的鉴定 许多蛋白质在翻译中或翻译后在氨基许多蛋白质在翻译中或翻译后在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译后修饰。修饰约有翻译后修饰。修饰约有3030多种类型。多种类型。Post-Translational Modifications(PTM)酰胺化甲硫基化氨甲酰化次磺酸亚磺酸脱酰胺化甲酰化豆蔻酸化辛基化棕榈酰化硫辛酸化亚硝基化磷酸吡哆醇化磷酸泛酰巯基乙胺化三棕榈酸 三棕榈酸化瓜氨酸化最常见修饰包括磷酸化，糖基化。蛋白质的糖基化修饰和磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，因此也是目
45、前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点。第一节 磷酸化蛋白质的鉴定一 生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能Analysis of the entire complement of phosphorylated proteins in cells:“phosphoproteome”。蛋白质磷酸化是最常见、最重要的共价修饰方式。在哺乳动物细胞周期中，大约有13的蛋白质发生过磷酸化的修饰，在脊推动物基因组中，有5的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶(kinase)和磷酸(酯)酶(phosphatase)。蛋内质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育
46、和分化，细胞骨架调控、细胞凋亡等。真核细胞蛋白质的磷酸化翻译后修饰真核细胞蛋白质的磷酸化翻译后修饰一般是一般是O-O-磷酸化即磷酸化位点在蛋白磷酸化即磷酸化位点在蛋白质的质的丝氨酸丝氨酸(Ser)Ser)、苏氨酸苏氨酸(Thr)Thr)和和酪氨酪氨酸酸(Tyr)Tyr)残基侧链的羟基上。残基侧链的羟基上。原核生物中蛋白质的磷酸化位点常在原核生物中蛋白质的磷酸化位点常在组氨酸组氨酸(His)His)、天冬氨酸天冬氨酸(Asp)Asp)和和谷氨酸谷氨酸(Glu)Glu)，此外，此外，在赖氨酸在赖氨酸(Lys)Lys)、精氨酸精氨酸(Arg)Arg)和和半胱氨酸半胱氨酸(Cys)Cys)也会发生磷酸
47、化也会发生磷酸化修饰。修饰。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点白质的不同位点(不同的氨基酸顺序不同的氨基酸顺序)。真核细胞蛋白质中常见的几种磷酸真核细胞蛋白质中常见的几种磷酸化修饰氨基酸残基的结构化修饰氨基酸残基的结构二二.磷酸化蛋白质分析概述磷酸化蛋白质分析概述 传统的磷酸化蛋白质的分析有许多是利用传统的磷酸化蛋白质的分析有许多是利用体外激酶反应使蛋白质被磷酸化修饰，产生体外激酶反应使蛋白质被磷酸化修饰，产生足够用于分析的磷酸化蛋白，经化学或质谱足够用于分析的磷酸化蛋白，经化学或质谱分析确定磷酸化位点，例如分析确定磷酸化位点，例如EdmanEdma
48、n测序和串联测序和串联质谱测序。同时为了证明体外研究确定的磷质谱测序。同时为了证明体外研究确定的磷酸化位点确实具有生物学意义，还必须证实酸化位点确实具有生物学意义，还必须证实在体内存在相同的磷酸化位点。在体内存在相同的磷酸化位点。通常通过比较磷酸化蛋白质的二维磷酸肽通常通过比较磷酸化蛋白质的二维磷酸肽图得以证实。当体内和体外同一磷酸化蛋白图得以证实。当体内和体外同一磷酸化蛋白质酶切后各自的磷酸肽在二维谱图中共迁移质酶切后各自的磷酸肽在二维谱图中共迁移时，可认为体内、体外磷酸化蛋白有相同的时，可认为体内、体外磷酸化蛋白有相同的磷酸化位点。磷酸化位点。传统分析方法的局限性传统分析方法的局限性 这个
49、方法间接确定了体内蛋白质的磷酸这个方法间接确定了体内蛋白质的磷酸化位点，并未直接分析体内磷酸化蛋白化位点，并未直接分析体内磷酸化蛋白质；质；在分析中为了追踪磷酸化蛋白质和磷酸在分析中为了追踪磷酸化蛋白质和磷酸化肽段，一般都要采用放射性标记，所化肽段，一般都要采用放射性标记，所以存在放射性污染的问题；以存在放射性污染的问题；一次只能分析一个目的蛋白质，不适应一次只能分析一个目的蛋白质，不适应蛋白质组大规模、整体分析的策略蛋白质组大规模、整体分析的策略。现在技术现在技术 从蛋白质组的规模上分析磷酸化蛋白质，从蛋白质组的规模上分析磷酸化蛋白质，目前最常用的分离技术还是二维凝胶电泳技目前最常用的分离技
50、术还是二维凝胶电泳技术。术。细胞蛋白质经二维凝胶电泳分离后，磷酸细胞蛋白质经二维凝胶电泳分离后，磷酸化蛋白质的检测通常用化蛋白质的检测通常用3232P P放射性标记放射自放射性标记放射自显影和抗磷酸氨基酸抗体免疫反应的方法。显影和抗磷酸氨基酸抗体免疫反应的方法。磷酸化蛋白质的鉴定可以用肽质量指纹谱方磷酸化蛋白质的鉴定可以用肽质量指纹谱方法或串联质谱测序方法；磷酸化位点的鉴定法或串联质谱测序方法；磷酸化位点的鉴定可用磷酸酶法、串联质谱侧序法等。有些情可用磷酸酶法、串联质谱侧序法等。有些情况下，在质谱分析前还需要对磷酸肽进行富况下，在质谱分析前还需要对磷酸肽进行富集，如金属螯合离子亲和提取法。集，
