1、仅供医学交流使用肺癌基因检测进展“Personalized medicine is the tailoring of medical treatment to the individual characteristics of each patient.”As defined by the Presidents Council of Advisors on Science and Technology(PCAST)个体化医学/治疗肺癌检测的进步Li T,et al.J Clin Oncol,2013 Mar 10;31(8);1039-49病理基因诊断是基础病理基因诊断是基础 组织活检 vs
2、液体活检标本来源标本来源组织活检组织活检液体活检（液体活检（CfDNA/CTC)DNA含量充足少量获取难易度难易身体创伤大小异质性存在存在基因检测灵敏度高差对于检测设备要求低？高？动态检测难度大可行费用较多？少？Crowley,E.et al.Nat.Rev.Clin.Oncol.2013,10:472484 Low concentration:average 17 ng/ml plasma in advanced-stage cancers Low proportion:tumor DNA can range between 0.01%and 93%手工染色效果巴氏染色巴氏染色HE染色染色瑞
3、氏瑞氏-姬姆萨染色姬姆萨染色Diff染色染色总览肿瘤细胞粒细胞传统染色方法进行CTCs形态学观察有关图片及标准由细胞学王征教授提供条件1：细胞核异型性，阅片中可对比围周其他白细胞作为一个重要方法，判断其是否异型。条件2：核质比大于0.8条件3：细胞直径（长端）大于15um 条件4：核深染且着色不均匀（由于癌细胞染色质增多，颗粒变粗，核深染）条件5：核膜增厚，出现凹陷或皱褶，使核膜呈锯齿状条件6：细胞核染色质边移（核偏位），或巨大核仁，或异常核分裂。CTC判读标准判读标准 CTC：符合：符合4个或个或4个以上，判读为个以上，判读为CTC，如满足条件，如满足条件6，外加符合其它两个条件也可判读为，
4、外加符合其它两个条件也可判读为CTC；疑似疑似CTC：满足条件：满足条件6之外的任意之外的任意3个条件；或单独满足条件个条件；或单独满足条件6，判读为疑似，判读为疑似CTC；CTC clusters:3个及个及3个以上的个以上的细胞成团，且能鉴定为细胞成团，且能鉴定为CTC；或；或因相互连接重叠无法准确判读为因相互连接重叠无法准确判读为CTC的细胞团，但能判断为非血液来源的具有核异形特征，且不是围绕滤膜孔呈花瓣状分布的细胞的细胞团，但能判断为非血液来源的具有核异形特征，且不是围绕滤膜孔呈花瓣状分布的细胞团，判读为团，判读为CTC clusters；疑似疑似CTC clusters：3个及个及3
5、个以上的细胞成团，但不足以判定为个以上的细胞成团，但不足以判定为CTC的细胞团，且核异形不明显的细胞团，且核异形不明显，判读为疑似，判读为疑似CTC clusters。评 判 标 准首先具有恶性特征的细胞团；首先具有恶性特征的细胞团；CTC clusters成团；成团；CTC clusters有胞浆；有胞浆；CTC clusters可能存在排列；可能存在排列；CTC clusters可能出现立体结构，核拥挤。可能出现立体结构，核拥挤。CTCCTC clustersCK8/18/19CD45VimentinHoechstMergedCK8/18/19CD45VimentinHoechstMerg
6、edCK8/18/19CD45VimentinHoechstMerged IF检测：临床样本中检测：临床样本中CTC的异质性的异质性CTC的检测的应用前景体外早期诊断指导个体化治疗包括临床药物筛选耐药性的检测肿瘤复发的监测肿瘤新药物的开发相对全面的分子分型和靶向治疗策略 腺癌趋向更加精细 鳞癌获得更多分型 小细胞肺癌的分型 分型由单个biomarker向pathway发展 多分子多平台分型技术的挑战TCGA项目为代表项目为代表二代测序等通量技术的应用多个信号通路中的关键分子变异频率肺鳞癌肺鳞癌 64%64%肺腺癌（肺腺癌（62%to 78%)62%to 78%)首创深度测序肿瘤个体化建档法更加
7、经济、高敏感性的检测ctDNA方法selector能识别139个频发突变基因中的521个外显子和12个内含子II-IV期的NSCLC中检测敏感性100%，I期的NSCLC中敏感性为50%，而且在各期的肺癌中的特异性均在96%published online 6 April 2014仅供医学交流使用诊断技术的进步对临床有何指导意义使用新一代测序(NGS)对小细胞肺癌(SCLC)进行前瞻性分子分析病理诊断病理诊断SCLC病理病理医生在医生在MSK中心对福尔马林中心对福尔马林固定石蜡包埋固定石蜡包埋标本进行评估标本进行评估NGSFISH:FGFR1及MET扩增IHCMGMT,PTEN MSK-IMP
8、ACT：靶向：靶向NGS，能，能分辨分辨常规一套常规一套222种肿瘤相关基因的种肿瘤相关基因的单核苷酸变异、单核苷酸变异、插入和插入和缺失以及拷贝数变化缺失以及拷贝数变化 FGFR1：使用：使用Zytolight SPEC FGFR1/CEN8双色双色探针探针 MET：使用：使用Cytocell探针探针 基于基于预先预先制定的定义来判制定的定义来判断扩增断扩增 每每种需要种需要2份未着色切片份未着色切片 MGMT：英杰公司：英杰公司MGMT鼠鼠单克隆抗体单克隆抗体 阴阴性性=无表达无表达 阳性阳性=任何表达任何表达 PTEN：Dako PTEN鼠单克鼠单克隆抗体隆抗体 H评分评分=细胞细胞%强
9、度强度(2份未份未着色着色切片切片)，评分范围，评分范围0-300研究检测研究检测收集人口统计学及临床数据；收集人口统计学及临床数据；根据吸烟状态、分期及对治疗缓解情况对基因型分析数据进行分层；根据吸烟状态、分期及对治疗缓解情况对基因型分析数据进行分层；临床研究选择临床研究选择Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.MSK-IMPACT结果Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.平均覆盖深度420X中位突变数量(每肿瘤)配对(N=35)/未配对(N=15)7/16 局限性疾病(N=21)9 广泛性疾病(N=
10、29)5 难治(N=15)4 敏感(N=31)7观察了222个癌症相关基因，发现202个基因突变发现526个非同义突变，其中25%为功能缺失突变主要突变为GT颠换(46.8%)，反映了烟草烟雾致癌物质对DNA的影响最常见突变基因Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.90%90%40%36%30%32%32%26%26%12%10%RB1TP53SOX2CDKN2CEPHA5KMT2CNKX2-1PIK3CAMYCLFGFR1PTEN扩增纯合子缺失错义突变截断突变非移码突变吸烟与突变：吸烟对DNA的影响Pietanza MC,et al.2015 A
11、SCO Abstract 7518.突变率突变率(根据年吸烟包数根据年吸烟包数)GT颠换率颠换率(根据年吸烟包数根据年吸烟包数)34.58.58.602468100(N=4)1-20(N=2)21-40(N=14)40(N=15)年吸烟包数年吸烟包数平均非同义突变数平均非同义突变数0%5%35.4%31.6%0%10%20%30%40%0(N=4)1-20(N=2)21-40(N=14)40(N=15)年吸烟包数年吸烟包数GT颠换颠换率率吸烟与突变：从未吸烟患者突变情况Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.样本突变基因突变表现突变蛋白质突变碱基对患
12、者1 PHOX2BNOTCH1RB1TP53TP53TET6错义突变移码插入剪接位点移码缺失移码缺失扩增P82LP2485fsR500_剪接V218fsV73fsGAGA患者2CBLGNASMYCL错义突变错义突变扩增C401SM102VGCAG患者3TP53RB1CDKN2CMYCL无义突变移码插入扩增扩增R342T197fsGA患者4(难治性疾病)RB1ETV1无义突变扩增C666显著突变基因(根据对一线治疗疗效)Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.基因敏感(N=31)难治(N=15)P值MITFMLH1SHQ1PBRM1SETD2RAF1
13、VHLCDH1CDK8IDH2TET1FGFR34432211000007665553222220.0120.0370.0150.0170.0170.0040.0070.0380.0380.0380.0380.038ASXL1MCL1MYCCSF1RFGFR4DDDRPIK3R11087777700000000.0130.0300.0460.0460.0460.0460.046难治难治敏感敏感富集于难治性疾病患者的突变倾向于缺失富集于难治性疾病患者的突变倾向于缺失(chr 3p)富集于敏感性疾病的突变包括扩增、缺失及突变富集于敏感性疾病的突变包括扩增、缺失及突变显著突变基因(根据对一线治疗疗效
14、)121064082敏感敏感DualGainLOFLOSSMISS/IFASXL1MCL1DDR2PIK3R1MYCCSF1RFGFR4MLH1MITFSHQ1SETD2PBRM1RAF1VHL敏感肿瘤数敏感肿瘤数86420难治难治DualGainLOFLOSSMISS/IFMITFMLH1SHQ1SETD2RAF1PBRM1VHLCDH1CDK8IDH2TET1FGFR3难治难治肿瘤数肿瘤数常见常见突变突变常见常见突变突变Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.显著突变基因(根据疾病分期)与广泛性疾病相比，局限性疾病在更多数量的基因上存在更多突变P
15、ietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.1009080706050403020100突变患者突变患者%VHLASXL1EPHB1NOTCH1PIK3R1FLT4CDKN2BAURKAPDGFRAFGFR4TMPRSS2ESR1KDRFAM123BNOTCH4FAM46CHRASKEAP1局限性疾病(n=21)广泛性疾病(n=29)新一代测序结果验证Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.12345678910 1112 131415 161718 19 20212201234012345肿瘤/正常比例肿瘤/正
16、常比例FGFR1扩增扩增PTEN丢失丢失12345678910 1112 131415 161718 19 202122基因位置基因位置SCLC突变能否成为治疗靶点？Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.1009080706050403020100TP53RB1SOX2CDKN2CMLL3EPHASNKX2-1PIK3CATGFBR2BC16EPHA3MITFFAT1MYCL1TOP1BRCA2MLH1APCASXL1EPHB1FLT3IL7RJUNPTPRTRICTORSHQ1TERTTP63PTEN突变患者突变患者(%)最常见突变基因最常见突变
17、基因%配对(N=35)%未配对(N=15)GFGR1MYCL1扩增扩增alisertib+紫杉紫杉醇醇NCT02038647FGFR1扩增扩增BYL719+BGJ398NCT01928459Debio1347NCT01948297PTEN丢失丢失BYL719+依维莫斯依维莫斯NCT02077933PIK3CA突变突变BYL719+BGJ398NCT01928459BYL719+依维莫斯依维莫斯NCT02077933VS-5584NCT01991938研究结论在可获得的肿瘤样本对SCLC进行全面分子分析是可行的此研究发现验证了既往的回顾性研究的结果 TP53及RB1失活常见 SOX2扩增、FGF
18、R1扩增及PTEN丢失突变发生率相当4例不吸烟者被纳入本研究队列 他们的肿瘤突变更少，且无一存在GT颠换纯合子缺失在难治性疾病中更常见相较局限期疾病，广泛期疾病与突变数量增加不相关对于SCLC基因突变与临床结局相关性，以及将这些患者与合适的靶向治疗联系起来的分析正在进行中Pietanza MC,et al.2015 ASCO Abstract 7518.前瞻性评价接受厄洛替尼治疗的EGFR突变NSCLC患者的游离循环DNA(cfDNA)基因型分析及循环肿瘤细胞(CTC)目的：量化CTC及cfDNA分析对EGFR突变的NSCLC接受一线厄洛替尼治疗的预测价值Yanagita M,et al.20
19、15 ASCO Abstract 11068.II期厄洛替尼研究期厄洛替尼研究进展时，如可行则重复活检未接受过TKI治疗的EGFR突变NSCLC在基线(治疗前)及随访期间每2月：收集cfDNA及CTC分析配对血样本应用ddPCR进行血浆基因型分析：EGFR19缺失、L858R,T790M通过CellSearch分离CTC运用IF和MET-FISH对其进行分析研究结果：患者情况Yanagita M,et al.2015 ASCO Abstract 11068.患者情况例数N(%)EGFR突变60(100)L858R17(28.3)19缺失38(63.4)其他5(8.3)终止厄洛替尼治疗44(73
20、.3)因进展39(65)因不良事件5(8.3)研究结果：cfDNA分析Yanagita M,et al.2015 ASCO Abstract 11068.基线分析：共基线分析：共53例例 EGFR突变突变47.1%(n=25)每每mL血浆血浆拷贝拷贝数：数：中中位：位：57,范围范围:2-1649进展时分析：共进展时分析：共33例例 EGFR突变突变30.3%(n=10)每每mL血浆血浆拷贝拷贝数：数：中中位位：71,范围范围:5-2530研究结果：CTC分析Yanagita M,et al.2015 ASCO Abstract 11068.2例患者例患者CTCs中检测出中检测出MET扩增扩增
21、基线分析：共基线分析：共47例例进展时分析：共进展时分析：共33例例CTCs36.9%(n=17)CTCs45.4%(n=15)每每7.5mL血血CTCs：中中位位：3,范围范围:1-1145每每7.5mL血血CTCs：中位中位：6,范围范围:1-328疗效预测：cfDNA对比CTCs基线及随访3个月以上可检测cfDNA的患者(n=18)0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%90.00%至至未能检测出未能检测出cfDNA(治疗治疗降低降低cfDNA,4个个月月)83.8%(n=15)Yanagita M,et al.2015
22、ASCO Abstract 11068.l 基线可检测到CTCs的患者(n=17)0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%始终始终未检测到未检测到CTCs的患者的患者*41.1%(n=7)始终不间断检测到始终不间断检测到CTCs的的患者为患者为58.9%(n=10)研究结论游离循环DNA(cfDNA)基因型分析及循环肿瘤细胞(CTC)均为非侵入性的NSCLC患者EGFR突变检测方法相较CTCs，连续的cfDNA监控可能是更好的疗效预测方法Yanagita M,et al.2015 ASCO Abstract 11068.IMPRESS研究中ctDNA EGFR突
23、变的回顾性分析主要终点：PFS次要终点：OS，ORR，DCR，安全性及耐受性，健康相关的生活质量探索性终点：生物标记物年龄18岁PS 0-1组织学证实IIIB/IV期EGFR突变阳性晚期NSCLC未接受化疗治疗达到CR/PR4月或者SD6月一线使用吉非替尼入组疾病进展(RECIST)4周顺铂 75mg/m2培美曲塞 500mg/m2(6周)+吉非替尼 250mg顺铂 75mg/m2培美曲塞 500mg/m2(6周)+安慰剂250mgRKim SW,et al.2015 WCLC Abstract ORAL16.05.BEAMing方法检测 EGFR突变ctDNA(肿瘤标本与基线血浆水平对比)相
24、对于肿瘤组织，BEAMing dPCR血浆检测的良好性能有利于EGFR敏感突变检测Kim SW,et al.2015 WCLC Abstract ORAL16.05.血浆 dPCR 测定外显子19缺失，%(n/N)L858R突变，%(n/N)敏感性73.8(124/168)81.6(62/76)特异性96.7(89/92)95.3(161/169)一致性81.9(213/260)91.0(223/245)BEAMing方法检测 EGFR突变亚组ctDNA(261例肿瘤标本与基线血浆水平对比)IMPRESS患者人群总体T790M检测率：54.4%(142/261)与其他关于EGFR TKI难治人
25、群报告结果一致T790M+患者中，吉非替尼组与安慰剂组有轻微不平衡Kim SW,et al.2015 WCLC Abstract ORAL16.05.吉非替尼，%(n/N)安慰剂，%(n/N)总体，%(n/N)T790M(+)61.8(81/131)46.9(61/130)54.4(142/261)T790M(-)35.1(46/131)45.4(59/130)40.2(105/261)外显子19缺失(+)47.3(62/131)50.0(65/130)48.7(127/261)L858R(+)28.2(37/131)25.4(33/130)26.8(70/261)ctDNA分析：BEAMin
26、g 对比 QIAGEN therascreen EGFR RGQ PCR Kit检测方法BEAMing:T790M检测率较QIAGEN therascreen高QIAGEN therascreen检测能力与所取血浆中ctDNA量相关(与BEAMing类似，但数据未显示)Kim SW,et al.2015 WCLC Abstract ORAL16.05.突变外显子19缺失(n=260)L858R(n=253)T790M(n=246)血浆+检测率BEAMing48%28%57%QIAGEN therascreen37%20%15%P值0.00010.000199.9999%研究结果：EGFR突变E
27、GFR激活突变：8.9%(20/225)E19del：14 L858R：3 E20ins：2 G719A：1 EGFR T790M并存：7/20 EGFR扩增：6/20 中位EGFR突变年龄：62.5岁 女性：18/2014,70%3,15%2,10%1,5%EGFR突变类型E19delL858RE20insG719AMack PC,et al.2015 WCLC ORAL38.06.研究结果：非EGFR突变非EGFR突变 驱动基因融合：4 EML4-ALK：2 KIF5B-RET：2 ERBB2 E20ins：5 KRAS 12/13密码子突变：23 HRAS/NRAS：3 BRAF突变：6
28、1.782.2210.221.332.6702468101214突变患者比例非EGFR突变的发生率(%)驱动基因融合ERBB2 E20insKRAS 12/13密码子HRAS/NARSBRAFMack PC,et al.2015 WCLC ORAL38.06.研究结果：信号转导通路因子TP53突变：51%(116/225)截断或错义突变 NF1：6 PTEN：1 SMAD4：4 STK11：4基因扩增中信号转导因子占：66%MAF：0.06%-83.4%UC Davis研究点的病例分析(n=27)可作为靶点基因突变：77.8%MAF：最小等位基因频率：最小等位基因频率Mack PC,et al
29、.2015 WCLC ORAL38.06.研究结论高敏感高特异度的cfDNA分析显示出识别体细胞突变的能力，包括识别可作为靶点的基因突变当重复活检风险高或者无法进行时，采集血液进行cfDNA分析可以为治疗决策提供依据血浆cfDNA分析在不久的未来可作为侵入性肿瘤活检的补充Mack PC,et al.2015 WCLC ORAL38.06.Every patient is unique:precisely annotated!Toward Precision Medicine:Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease(2011)
