1、中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室基因工程原理基因工程原理何光源2016-3-10中英联合实验室中英联合实验室第三章 测序技术p第一节 DNA测序策略p第二节 传统的DNA序列分析法p第三节 第二代测序技术简介p第四节 第三代测序技术2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室造福人类的HGP人类基因组计划（Human Genome ProjectHGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组
2、计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第一节 DNA测序策略DNA的测序策略因待测DNA分子性质、测序方法和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以及现有设施来制定测序总策略。一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略 确证性测序（confirmatory sequencing）：对已知的核酸序列进行鉴定和证实；例如：临床分子诊
3、断中，对有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变；不仅有助于临床诊断，还有助于探索有关疾病的发病机理及基因突变引起的表型变化。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略 多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反应即可获得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只需对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序；待测DNA片段位于通用引物的测序范围之内时，可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为“通用引物”；否则，最好的方法是合成一段长度为18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。2022
4、-8-2中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室（一）随机测序法鸟枪法shotgun strategy 利用超声处理、核酸酶（DNase）切割或限制性酶切割，将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测定，然后将序列重叠排列，确定待测DNA的完整序列；该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准确；但由于测序的亚克隆是随机挑选出来，某些序列可能多次重复测定，而一些序列一直不出现，通常要测定比实际靶DNA所含核苷酸多47倍的序列；如果靶DNA含较多的重复序列，计算机将难以
5、进行分析。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）定向测序法定向测序法（directed sequencing）：指从待测DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待测DNA的序列全部测完；该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）定向测序法1嵌套缺失法 嵌套缺失法（nested deletion）：利用工具酶酶解待测DNA，只要控制消化时间，即可产生一组从同一端缺失的长度不一的互套缺失突变体，测定其序列，通过相互重叠部分将相邻片段的序列彼此拼接，如此重叠互套，获得待测DNA的全序列；产生互套
6、缺失突变体的主要工具酶：核酸外切酶III、核酸酶Bal 31、DNA酶I和T4 DNA聚合酶。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）定向测序法用外切酶构建互套缺失突变体测序方法示意图 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）定向测序法2引物步入法引物步入法（primer walking）：从待测DNA片段的3端开始，利用载体上的序列设计第一次反应的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进测序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）定向测序法引物步入法测序原理示意图 2022-8-2中英
7、联合实验室中英联合实验室Key Genomics Technologies 1975-Southern DNA hybridization technique 1977-Sangers chain-termination and Maxam、Gilberts chemical DNA sequencing methods 1980-Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument 1985-Mulliss discovery of PCR at Cetus 1992-Affymetrix(Fodors group)first gene
8、-chip 1995-ABIs first automated DNA sequencer 2006-2nd generation DNA sequencer on market 2007 and beyond Single molecule sequencing techniques2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室测序技术的发展p双脱氧末端终止法(Sanger 测序法)1970s 同位素标记，手工 1980s 荧光标记，自动 1990s 毛细管电泳p合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（Sequencing-By-Synt
9、hesis,Illumina/Solexa）连接测序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）p单分子测序技术（第三代测序）Helicos Pacific Biosciences Oxford Nanopore 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第二节 传统的DNA序列分析法pSanger双脱氧链终止法pMaxam-Gilbert DNA化学修饰法pDNA杂交测序p毛细管电泳pDNA序列分析的自动化2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室1970年发明了第一种DNA测序方法2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Sanger双脱氧链终止法Sanger
10、于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室一、基本原理单链DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链能够利用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核苷酸链的3-末端，从而终止DNA链的延长2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室 POHdNTP
11、ddNTP POHOH P P P POH2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室 在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。产生4组分别终止于互补链3末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室双脱氧链末端终止法测序原理示意图 2022-8-2中英联合实验室中英联
12、合实验室二、测序反应体系的组成（一）待测模板1单链模板DNA Sanger法经典测序反应-将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。2双链模板DNA 将待测的DNA片段克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片段的双链质粒，经碱变性处理，与寡核苷酸引物序列退火，按Sanger法进行测序；2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Sanger双脱氧-M13体系M13-噬菌体载体，可得到单链DNA序列Sanger双脱氧-pUC体系 pUC-质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8
13、-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室二、测序反应体系的组成（二）引物“通用”引物：在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物；通用引物长度：一般为1530个核苷酸。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室二、测序反应体系的组成（三）DNA聚合酶1大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：Sanger法最早使用的酶，具有53聚合酶和35外切酶活性，催化链延伸反应的
14、能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带；2测序酶（sequenase）：经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了35外切酶活性。酶活非常稳定，很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，测定较长DNA的首选酶；3Taq DNA聚合酶：PCR反应关键酶，在95的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室二、测序反应体系的组成（四）放射性核素标记的dNTP-32P-dNTP或-35S-dNTP。目前通常采用-35S-dNTP。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室二、
15、测序反应体系的组成（五）测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基序列；2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Maxam-Gilbert DNA化学修饰法1977年哈佛大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明原理：化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割产生一组具有不同长度的DN
16、A链混合物经凝胶电泳分离和放射自显影，读出待测DNA片段的核苷酸序列2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的化学切割反应的试剂：肼 hydrazine 联氨 NH2-NH2 硫酸二甲酯 dimethylsulphate 六氢吡啶2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室碱性条件下，肼与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用通过六氢吡啶作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂盐存在的条件下，肼同T的反应被抑制，只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应 由此区别C和C+T两种反应2022-8-2中
17、英联合实验室中英联合实验室硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）一种碱性的化学试剂 作用于DNA碱基环中的氮原子，使之甲基化 在中性的pH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱 碱性条件下磷酸分子从DNA链上脱落，造成链的断裂 鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3 六氢吡啶作用，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室CS载体系统：末端标记载体核酸内切酶Th111特点：产生5单碱基的突出末端，便于标记；Th111位点十分稀少；5突出末端可以是G或A，也可以是T或C
18、，选择性强；在载体中具有两个Th111 位点，可对克隆在载体上的片段任何一段作选择性标记2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室化学修饰法的优点：不需要体外酶切；只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。限制因素：测序胶的分辨率2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室DNA杂交测序原理：如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片段杂交，并形成完全的双链分子，可据此推断靶DNA序列相对应的互补序列步骤：将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交 比较分析与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系，据此推算靶DNA的核苷酸序列2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2
19、022-8-2中英联合实验室中英联合实验室两种操作方式：1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交2.应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室杂交测序的应用1.检测靶DNA的单碱基突变2.用于不同片段之间的序列比较分析 （同源性序列检测）3.用表达序列标签（EST）的矩阵芯片，检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况4.检测传统的测序技术所得DNA片段的核苷酸序列数据2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室毛细管电泳 以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使带电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。具有分
20、辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。常用于DNA测序的毛细管电泳形式有以下几种：（一）毛细管凝胶电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（一）毛细管凝胶电泳CGE，Capillary gel electrophoresis 将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍；主要以聚丙烯酰胺凝胶作筛分介质，它黏度大、抗对流，能减少溶质的扩散，有极好的分离效果，除用于DNA序列分析外，还可用于DNA片段的分离和PCR产物的分析。问题：制备凝胶柱费力；凝胶形成和电泳期间产生
21、的气泡影响分离；使用过程中焦耳热对分离介质的降解使毛细管的寿命缩短等。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（二）非凝胶基质毛细管电泳为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电泳用于DNA分析的研究越来越多；非凝胶基质：线性聚丙烯酰胺和纤维素衍生物非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分离效果。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室（三）阵列毛细管电泳CAE，Capillary array electrophoresis 将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装置，将多支毛细管并列进行分离与检测，以板凝胶电泳的优势
22、弥补了毛细管凝胶电泳的不足，可一次检测多个样品；阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电泳，是一种高速、高通量的测序法；使用非凝胶基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实现自动化的优点。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室DNA序列分析的自动化激光测序法终止标记系统 用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP；测序反应在同一反应管内进行，不必分成4管；反应产物按终止位置的碱基不同其3末端带有不同的荧光基团，被激发后产生不同的荧光；将反应产物加样于凝胶的同一加样孔，电泳分离后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检测将信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。
23、2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室激光测序法终止标记系统测序原理示意图 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室测序仪原理1.荧光标记BigDye Terminators-美国应用生物系统公司专利，四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种ddNTPs；一个反应管中完成循环测序反应，通过一个电泳道电泳即可完成测序任务；传统双脱氧链终止法：四个反应管循环测序反应，四个泳道电泳检测2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2.循环测序2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室377377型遗传分析仪型遗传分析仪310310型遗传分析仪型遗传分析仪31003100遗传分析仪遗传分析仪
24、37303730遗传分析仪遗传分析仪 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第三节 第二代测序技术简介第二代测序技术2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Next Generation SequencingSample fragmentationLibrary preparationSequencing reactionData analysis2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室表 目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息（2010年年初数据）厂商厂商RocheIlluminaABI技术技术454Solexa GASOLiD测序仪测序仪GS20FLXTiIIII
25、Ix123序列数目（百万）序列数目（百万）0.50.51.252810025040115320单末端测序（单末端测序（Single-end）读长（读长（bp）1002004003550100253550运行时间（天）运行时间（天）0.250.30.4335658通量（通量（Gb）0.050.10.515251416配对末端测序（配对末端测序（Paired-end）3个水稻基因组个水稻基因组/天天 12个水稻基因组个水稻基因组/天天 10个水稻基因组个水稻基因组/天天读长（读长（bp）2004002352502100225235250库序列长度（库序列长度（kb）3.53.50.20.20.23
26、32运行时间（天）运行时间（天）0.30.461010121016通量（通量（Gb）0.10.529502832Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。ABI SOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Roche 454 焦磷酸测序原理：循环芯片测序法cyclic-array sequencing 对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。优势：操作更简易、费用更低廉、广泛应用。2022-8
27、-2中英联合实验室中英联合实验室原 理荧光素酶荧光素酶硫酸化酶硫酸化酶焦磷酸焦磷酸荧光素荧光素氧化荧光素氧化荧光素可见光可见光2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室测序原理u体外构建好的两端带接头的单链DNA文库；u单链DNA文库在一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增u由于起始阶段模板浓度非常低，因此大部分包含磁珠的乳液滴都只含有一种模板；u经PCR扩增，每个磁珠只连有一种模板的扩增产物u打破为乳液滴，收集磁珠，加入芯片中；2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室测序原理u经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被置于芯片上的微孔中；u焦磷
28、酸法测序u每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦磷酸；u焦磷酸和腺苷酰硫酸在硫酸化酶的催化下生成ATP；u荧光素酶在ATP参与下将荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器检测到。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室工作流程文库制备乳液PCR焦磷酸测序加入含酶小微珠芯片制备2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室工作流程一、样品输入并片段化 基因组DNA、BAC等被打断成300800 bp的片段；对于小分子非编码RNA或者PCR扩增产物，直接使用二、文库制备 将A和B接头（3和5端具有特异性）连接到DNA片段上；接头将用于后续的纯化、扩增和测序步骤；具有A、B接头的单链DN
29、A片段组成了样品文库。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室工作流程三、一个DNA片段连接一个磁珠 单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段；磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，成为只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。四、乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个片段文库的扩增平行进行；每一个片段扩增后产生几百万个相同的拷贝；乳液混合物被打破，扩增的片段结合在磁珠上。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室工作流程五、测序 携带DNA的捕获磁珠（20m）
30、随后放入PTP板（PicoTiter Plate）的微孔（29 m）中进行后继的测序反应；反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到，有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，可以准确快速地确定待测模板的碱基序列六、数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息；提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室454 sequencing：Emulsion PCR(emPCR)Generatio
31、n of millions of clonally amplified templates on each beadNo cloning and colony pickingMix DNA Library&capture beads(limited dilution)“Break micro-reactors”Isolate DNA containing beads Create“Water-in-oil”emulsion+PCR Reagents+Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter carrying library DNAABMicro-rea
32、ctors Adapter complementEnrichAnneal Seqprimer2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室454 sequencing：Deposition of DNA beads into the PicoTiterPlateCentrifuge StepLoad Enzyme BeadsLoad beads into PicoTiterPlate 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室454测序系统图示A为液体试剂供应装置B为反应池C为光线检测成像系统和计算机控制系统2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室测序质量454测序技术的准确率在99%以上
33、；其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG；由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差；454测序平台的主要错误类型是插入-缺失。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略图b为鸟枪循环芯片测序法策略2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室454测序仪的先行者地位uLeamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍该技术的论文被引用了570多次u100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文（peer-reviewed publica
34、tions）都是使用454测序仪开展的研究2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室一个4Mb基因组和3个6Mb基因组测序 传统的Sanger测序法：需要好几个月的时间，454测序仪，一位实验人员，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周 使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果 发现了导致结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点，此研究成果使得人类最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2007年6月，James Watson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是
35、第一次使用非Sanger测序法获得了人类个体基因组序列，且第一次将个人基因组序列公之于众整个测序在两个月之内完成，花费不到100万美元，仅占耗时10年之久的人类基因组计划使用经费的千分之一，Venter基因组计划费用的百分之一2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室454测序仪最初的技术参数（每次可以获得两千万碱基序列，测序长度100bp，准确率96%）James Watson测序时的技术参数（一亿碱基序列，250bp，99%）个体基因组测序的费用由100,000美元降低到10,000美元，继而降低到1,000美元甚至更低2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Illumina Sol
36、exa 合成测序Illumina Solexa 合成测序基本原理2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Clonal Single Molecule Arrays单分子克隆Prepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequence1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experiment2022-
37、8-2中英联合实验室中英联合实验室Reversible Terminator Chemistry可逆终止反应All 4 labelled nucleotides in 1 reactionO PPPHNNOOcleavagesitefluor3blockNext cycleIncorporationDetectionDeblock;fluor removalODNAHNNOO3O5free 3 endXOH2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Sequencing-by-Synthesis(SBS)Cycle 1:Add sequencing reagentsFirst base inc
38、orporatedRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n:Add sequencing reagents and repeat5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Base calling from the raw dataThe identity of each base
39、 of a cluster is read off from sequential images根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室Solexa 测序 Workflow2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第四节 第三代测序技术第三代测序技术又称单分子测序技术，DNA在测序时，不需要经过PCR扩增，可以实现对每一条DNA分子的单独测序。主要分为两类：单分子荧光测序技术 新型纳米孔测序技术2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室单
40、分子荧光测序技术脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室新型纳米孔测序技术新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的
41、带电性质不一样，每一个核苷酸通过孔道时都能出现一种特定形式的电流改变，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第三代测序技术的特点u实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍；u实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基；u精度非常高，达到99.99%；2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室第三代测序技术的特点u直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差；u可以直接测甲基化的DNA序列，根据DNA聚合酶在甲基化位点与非甲基化时停顿的时间不同，可以判断模板是否甲基化。2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室思考题p阐述DNA的测序方法有哪些？p二代测序技术包括哪些类型？各有什么优势？2022-8-2中英联合实验室中英联合实验室2022-8-2
