1、&绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达四川大学生命科学学院四川大学生命科学学院生物科学基地班生物科学基地班目录123456实验背景实验背景实验用品及方法介绍实验用品及方法介绍实验流程实验流程实验原理实验原理具体实验步骤具体实验步骤实验结果预测实验结果预测7参考文献参考文献200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方面取得了突出成就。实验背景实验背景 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。 它是由238 个氨基酸构成的“-
2、桶” 型三维立体结构, 其中第 65 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。GFP的演化 通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基酸, 得到变异GFP。 目前应用较多的是GFP的突变体增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。 所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等GFPGFP性质性质1 1、检测方便、检测方便2 2、荧光稳定、荧光稳定3 3、无毒害、无毒害4 4、具有共用性和
3、通用性、具有共用性和通用性5 5、易于构建载体、易于构建载体6 6、可进行活细胞定时定位观察、可进行活细胞定时定位观察 GFP 的应用(1) 研究基因表达的调控元件和蛋白定位。(2) 研究基因表达的时序控制与空间定位 。(3) 可用于发育分子机理研究。(4) 筛选药物 。(5) 临床检验。(6) 转基因动物和植物的筛选标记 。干扰素干扰素电泳检测电泳检测重组质粒的构建重组质粒的构建电泳检测电泳检测酶切酶切pET28apET28a质粒酶切位点选择质粒酶切位点选择感受态细胞的制备感受态细胞的制备转化转化筛选及复筛及酶切验证筛选及复筛及酶切验证PCR检测检测IPTG诱导表达诱导表达SDS-PAGE检
4、测目的蛋白检测目的蛋白包涵体检测包涵体检测分离纯化分离纯化PCR扩增扩增EGFP目的基因获取目的基因获取引物设计引物设计实验用品及方法介绍实验用品及方法介绍研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。方法介绍 实验用品 PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoR、 Hind 、T4 DNA
5、连接酶、1 kb DNA ladder DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉等。 PCR仪、 凝胶成像系统、荧光显微镜DYY-6C电泳槽和电泳仪、高速台式离心机、UV2300 紫外可见分光光度计 目的基因：EGFP (720bp)的基因片段: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTAC
6、GGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCAC
7、AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
8、目的基因内限制性酶切位点如下：154 Eco57I 198 Eco57I 397 Eco57I 710 Bsp1407I 181 BsiI 序列来源：pEGFP-N3质粒 pET28a质粒表达质粒表达质粒 pET28a pET28a质粒质粒 （1 1）含有）含有T7LacT7Lac启动子启动子 （2 2）含有寡聚组氨酸链）含有寡聚组氨酸链（His-tag)His-tag) （3 3）其）其N N端含有端含有ThrombinThrombin蛋蛋白酶切位点。白酶切位点。 （4 4）Pet28aPet28a的抗性是的抗性是kanakana抗性，通常所用的表达菌株抗性，通常所用的表达菌株是是BL21B
9、L21（DE3DE3），），BL21BL21（DE3DE3）GoldGold等等BL21BL21（DE3DE3）系列的）系列的宿主菌。宿主菌。 BL21BL21（DE3DE3）带有）带有 T7 RNA T7 RNA 聚合酶基因的聚合酶基因的 DE3 DE3溶原菌溶原菌,T7 RNA ,T7 RNA 聚聚合酶基因由合酶基因由 lacUV5 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。 大肠杆菌的表达系统：大肠杆菌的表达系统：实验流程实验流程
10、实验原理实验原理1.质粒质粒DNA的提取的提取1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性
11、剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。实验原理2.质粒质粒DNA的检测的检测琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质
12、在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的
13、DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。实验原理3.酶切及连接酶切及连接限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类，在分子克隆中常用II型限制性内切酶，Bam HI 和Hind III 都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异核苷酸序列内，切断的双链，形成一
14、定长度和顺序的片段。Bam HI 和Hind III的识别序列和切口是：Bam HI：GGATCCHind III： AAGCTTDNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的-OH，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)实验原理4. 重组质粒转化到大肠杆菌的表达系统（重组质粒转化到大肠杆菌的表达系统（BL-21）中）中细菌处于外源DNA的生理状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，在有氯化钙存在的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的
15、羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有抗生素的选择培养基上。实验原理5.重组绿色荧光蛋白（重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达）的诱导表达载体具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码的肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。lacZ基因编码的肽链与失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称之为-互补。由-互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）显色测定出来。因此，任何携带着lacZ基
16、因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ 中的 多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有活性的半乳糖苷酶，因此，用紫外线照射后，含有重组质粒载体的克隆就是绿色菌落。Part01Part02Part03具体实验步骤P01质粒DNA的提取质粒DNA的提取P02质粒DNA的提取P03感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素
17、的LB液体培养基中，37 , 180 r/min振荡培养过夜。 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。Part01Part02Part03具体实验步骤P04质粒DNA的提取质粒DNA的提取P05质粒DNA的提取P06 向离心管中加入150 l用冰预冷的溶液，用微量移液器吹打重悬沉淀。加入200 l新配制的溶液 ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟加入150 l用冰预冷的溶液 ，轻轻混匀，冰上放置35分钟。Part01Part02Part03具体实验步骤P07质粒DNA的提取质粒DNA的提取P08质粒DNA的提取P09
18、 用微量离心机于4 、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。 加等体积氯仿400 l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。 用70%乙醇洗涤2次，再次4 、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 l超纯水溶解质粒DNA，加入TE缓冲液（其中含2 l 10 mg/ml RNA酶），37 处理1小时后于-20 贮存。吸取上清液300 l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 、11000 rpm离心5分钟，弃上清。 质粒DNA的检测1.琼脂糖凝胶板的制
19、备质粒DNA的检测2.加样质粒DNA的检测3.电泳质粒DNA的检测4.观察和拍照具体实验步骤称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1L Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5L与1L Loading Buffer（ 6 ）混匀，加入胶板的样品小槽内。将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左
20、右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，停止电泳。将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。具体实验步骤酶切酶切及连及连接接分别取两支0.2mlEP管做上记号：如两个EP管中分别配置下列的30 L体系：具体实验步骤5.3.酶切及酶切及连接连接4.将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切1h。取5L EP管的酶切反应液，同时取5L原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段具体实验步骤酶切酶切及连及连接接在EP管中分别配置下列的体系：具体实验步骤1.取1
21、00 l感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 l经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。2.3.4.5. 吸取200 l菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。转入50ml离心管中，4000r/min离心10min,弃上清液，收集菌体。42水浴热激70 s，立刻于冰上放置2 min。加入200 l 含抗生素的LB液体培养基，37 ，60 r/min震荡培养30 min。四支EP管中加入0.5 l 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPT
22、G诱导。重组质粒转化到大肠杆菌的重组质粒转化到大肠杆菌的表达系统（表达系统（BL-21）中）中具体实验步骤123用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。4重组绿色荧光蛋白（重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达）的诱导表达 取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 150-220 r/min过夜培养。将20 l菌液按1：50100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 200r/min培养2h。按IPTG: LB培养基按1:1000加入2 l的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液
23、3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层。若成功提取，需经限制性内切核酸酶酶切及琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。质粒DNA的提取实验结果预测实验结果预测质粒DNA的鉴定实验结果预测含目的基因的重组质粒，得到有两条带，前面第一条带为GFP基因片段，第二条带为质粒载体，则成功构建了重组质粒pET-28a-GFP。若EGFP基因成功连接到pET-28a载体，PCR扩增后产物经过电泳检测，可以看到明显的一条亮带，其大小约为750 bp。其前面不明显的弥散的条带为引物二聚体。电泳检测结果电泳检测结果泳泳道道1234567样品YFP-8YFP-7YFP-6YFP-5YFP-028aM样量20作用本组
24、诱导前对照空载体对照分子量标准泳道中出现三条带。最前面的带是目的基因片段大约500bp左右，还有一条带在其后，是克隆载体片段，分子量比目的表达基因大：未酶切的条带在最后，分子量较大。酶切及连接实验结果预测实验结果预测实验组实验组对照组重组质粒转化到大重组质粒转化到大肠杆菌的表达系统肠杆菌的表达系统（BL-21）中）中日光灯紫外灯实验结果预测在日光灯和紫外光下，携带重组质粒pET-28a-GFP的大肠杆菌BL-21用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌BL-21体内成功表达；而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光。重组绿色荧光蛋白（重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导
25、表达）的诱导表达1.马金石. 绿色荧光蛋白 J . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 -250.2. 季爱加, 宁喜斌 原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表达 微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷3.默芳 王恩多 绿色荧光蛋白 生物化学与生物物理进展 2000：27（3）4.邓超等.绿色荧光蛋白及其应用.中国生物工程杂志.2011,31(1): 96-102.5. 梁国栋. 最新分子生物学实验技术 M . 北京: 科学技术出版社, 2001, 174.6. 贾艳华，李国勋，张杰 .荧光蛋白及其应用7. 杜祯, 马海利, 陈瑞芳.工程菌DH-5感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究中国畜牧兽医,2007 年第34卷第5期8. 魏春红，李毅主编 聚合酶链反应-PCR 现代分子生物学技术 高等教育出版9. 魏春红，李毅主编 原核细胞中外源基因的表达和初步纯化，现代分子生物学技术，高等教育出版社，2006.7:95-9 谢谢观赏thankyou3.28
