1、实验肿瘤药理学抗肿瘤药物的药效学评价 11基本知识l1.1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容l1.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识l1.2.1实验动物模型实验动物模型l1.2.2肿瘤学基本知识肿瘤学基本知识l1.2.2.1肿瘤细胞的生物学特征肿瘤细胞的生物学特征l1.2.2.2肿瘤细胞生长的特征肿瘤细胞生长的特征l1.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l1.3.1恶性肿瘤研究的历史恶性肿瘤研究的历史l1.3.2抗肿瘤药物的研究抗肿瘤药物的研究22.样品抗肿瘤活性的确证（一）体内筛选实验l2.1概述概述l2.
2、2动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种l2.2.1动物的选择动物的选择l2.2.2移植瘤的接种移植瘤的接种l2.3移植性动物肿瘤的质量移植性动物肿瘤的质量鉴定鉴定l2.4待筛样品的制备待筛样品的制备l2.5剂量的选择、动物分组剂量的选择、动物分组及数量及数量l2.5.1剂量的选择剂量的选择l2.5.2动物分组动物分组l2.6疗效评价疗效评价l2.7瘤株的选择瘤株的选择l2.7.1常用瘤株的介绍常用瘤株的介绍l2.7.2瘤株的选择瘤株的选择l2.8举例举例l2.9人体肿瘤裸鼠异种移植人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型动物模型33.样品抗肿瘤活性的确证（二）体外筛选实验l3.1原理与基本操作要点原理
3、与基本操作要点l3.1.1实验原理实验原理l3.1.2基本操作要点基本操作要点l3.2常用的肿瘤细胞株介常用的肿瘤细胞株介绍绍l3.3抗肿瘤药物体外筛选抗肿瘤药物体外筛选的实验设计的实验设计l3.4常用的评价方法常用的评价方法l3.4.1细胞拒染法细胞拒染法l3.4.2生长曲线法生长曲线法l3.4.3克隆计数法克隆计数法l3.4.4MTT法法l3.4.5SRB法法l3.5其它评价方法其它评价方法 41基本知识新知识新理论新技术新方法新材料创新药物药学研究新药化学结构的确证工艺线路理化常数、纯度、含量测定临床前药理学研究工作药物有效吗？药物使用安全吗？药物在体内的过程如何？上报SFDA审批通过药
4、物临床研究上报SFDA审批通过药品生产与销售药物临床使用、监测新药研究开发的基本过程：1.1实验药理学在新药研究开发中的实验药理学在新药研究开发中的作用与内容作用与内容51.1实验药理学在新药研究开发中的作用与实验药理学在新药研究开发中的作用与内容内容抗癌（细胞毒类）药物筛选研究的基本过程待筛化合物生化筛选测定体外人类肿瘤细胞株系统筛选体内模型复筛毒理学研究临床实验61.1实验药理学在新药研究开发中的作用与实验药理学在新药研究开发中的作用与内容内容l2019年全世界上市的新药（新的活性物质）一共28个，20个是新的化学物体，其中8个抗感染药物，其余12个药中，抗肿瘤药和中枢神经系统用药各占4个
5、。l抗肿瘤的药品市场是仅次于心血管药物及中枢神经系统用药的第三大药品市场，预计，至2019年，全球抗肿瘤药物的市场的市值将达到600亿美元。71.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识l1.2.1实验动物模型实验动物模型l药效学实验研究工作中，建立人类疾病的实验动物模型至关重要，成功动物模型的建立是药效学实验研究的根本。l实验动物模型应该具备的条件：动物的致病因素、发病机理、病理变化、评价指标、病程发展与转归应该与人类疾病一致或相近；实验操作简便，成功率高，重现性好，便于推广。所需实验动物能够方便提供，比如能够人工繁育，提供的动物具有相应的国家标准，实验成本适中。l肿瘤
6、学实验中小鼠的使用占有绝对的优势，它具有如下的优点：敏感 模型比较容易复制；潜伏期短 复制速度快；其形态特征等与人类肿瘤相似；裸小鼠的应用使得实验结果更加接近临床实际；易于大量繁殖并有可靠的质量保证。81.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识l1.2.2肿瘤学基本知识肿瘤学基本知识l1.2.2.1癌细胞的生物学特征：癌细胞的生物学特征：l癌细胞对于控制正常细胞增殖和分化的调节因素不能正常地发生反应，通常表现出持续性增殖和分化不良的倾向。绝大多数恶性肿瘤（癌）细胞则丧失了接触性抑制这一生物学特性。l癌细胞表现出与邻近细胞及组织间关系的异常，改变了正常的组织结构形式，表现
7、为浸润性生长和播散转移。l癌细胞能够把上述恶性特征遗传给它的下一代（子细胞）。91.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识l1.2.2.2肿瘤细胞生长的特征肿瘤细胞生长的特征l肿瘤细胞的生长速度不是恒定不变的，通常为迅速生长和相对稳定状态相互交错出现。大多数情况下其恶性程度逐渐增加。l恶性肿瘤组织增长的速度取决于三个因素，即细胞生长周期、增殖比例和细胞的丢失。l绝大多数肿瘤细胞的细胞周期时间短于肿瘤体积的倍增时间。一般而言，实体瘤的细胞周期时间比其母体组织为长。101.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识l在肿瘤组织中，肿瘤细胞分为增殖细胞和不
8、增殖细胞。增殖细胞包括增殖能力有限的肿瘤细胞和增殖能力无限的肿瘤干细胞。不增殖细胞包括G0期细胞和G1、G2期阻断细胞。其中肿瘤干细胞和G0期细胞具有重要的生物学意义。l肿瘤的间质成分包括纤维母细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。一般而言，间质成分不断改变以适应肿瘤的生长。l肿瘤细胞能够产生肿瘤血管生成因子（TAF），TAF能够诱导新生的毛细血管生成，为快速增长的肿瘤组织提供营养，若阻断肿瘤毛细血管的生成，则肿瘤组织仅停留于直径23mm大小而无法增长。111.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l1.3.1恶性肿瘤研究的历史恶性肿瘤研究的历史l1000多年前 肿瘤的临床观察
9、，分类与治疗。l1775年 发现阴囊癌与接触煤焦油密切相关。19世纪后半叶发现膀胱癌与苯胺染料接触相关，引起人们对化学致癌的关注。l1856年 制定判断肿瘤细胞的标准。l1876年 建立肿瘤的研究模型。l1900年 成功的培育纯系动物，使得肿瘤学研究得以大踏步的向前迈进。l1908年 发现鸡白血病。l1911年 发现Rous肉瘤病毒，确定了病毒致癌的病因，该发现获得1966年诺贝尔奖。l1918年 发现兔耳长期涂抹煤焦油诱发皮肤肿瘤。l1933年 成功分离得到煤焦油中的致癌成分苯并芘，后又分离得到促癌成分佛波酯，化学致癌学说得以确立。121.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l
10、1969年 癌基因假说提出。l1973年 基因重组技术成功。l1975年 第一个病毒癌基因Sre分离成功，并因此获得诺贝尔奖。l1981年 从人的肿瘤中分离得到Ras癌基因，迄今为止已发现癌基因100多个）l1986年 第一个抗癌基因Rb被克隆。l1989年 明确p53基因为抗癌基因。（1983年发现以来一直没有定性；该基因为目前已知的在恶性肿瘤中突变率最高的抗癌基因）。l2019年 NCI开始执行“肿瘤基因索引计划（tumor gene index program,TGIP）”l21世纪以来 分子生物学技术高速发展加速了人们对肿瘤本质的认识，人们正在一步一步的揭开肿瘤神秘的面纱。131.3抗
11、肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l1.3.2抗肿瘤药物的研究抗肿瘤药物的研究l肿瘤的药物治疗是肿瘤三大经典（即手术、化疗和放疗）治疗手段之一。经典的化疗药物（细胞毒类药物及对肿瘤细胞具有直接杀伤作用的药物）的研究大致起步于20世纪三、四十年代。141.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l具有重要意义肿瘤化疗药物的内容具有重要意义肿瘤化疗药物的内容：l1946年 研制成功烷化剂类抗肿瘤药物噻替哌、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥。（耶鲁大学Glman等人，后于1958年德国研制成功另一个烷化剂环磷酰胺）l1947年 研制成功抗代谢药物甲氨喋呤、6-巯基嘌呤。（Hitchin
12、gs and Elion，并以此而获得2019年诺贝尔医学奖，后又陆续研制成功5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷等）151.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要l1954年 研制成功第一个抗生素类抗肿瘤药物放线菌素-D（Farber，亦称更生霉素，后又分别研制成功丝裂霉素、博来霉素、阿霉素等）l1955年 植物中分离得到第一个天然药物有效成分并使之成为抗肿瘤药物长春花碱和长春新碱。（加拿大的Noble和美国Lilly公司的Johnson，后又研制成功三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、喜树碱、紫杉醇、VP-16等）l1965年 成功研制抗肿瘤药物顺铂。（Rosenberg，后又研制成功卡铂等）162.
13、样品抗肿瘤活性的确证（一）样品抗肿瘤活性的确证（一）体内筛选实验体内筛选实验 l经典的体内、体外抗肿瘤实验是其它肿瘤学基础研究以及抗肿瘤药物作用机制研究的基础。l抗肿瘤药物体内筛选评价的基本原理是：首先建立肿瘤的实验动物模型，在成功建立肿瘤动物模型的基础上，给以动物实验样品进行抗肿瘤治疗，最后通过观察治疗效果对药物的有效性、安全性以及作用特点做出正确的评价。172.1概述概述 l实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同，可以分为自发性肿瘤、诱发性肿瘤以及移植性肿瘤。l自发性肿瘤的特点是自发性肿瘤的特点是病程于人类肿瘤发生最为接近，发病年龄很大，发生率尽管很高，但是大多不能够达到百分之百。动物品系
14、肿瘤组织类型发生率月龄C3HDBA/1AAKRPBAC57BL乳腺癌乳腺癌肺瘤（癌）淋巴细胞性白血病淋巴瘤 网织细胞肉瘤99%75%90%91%100%74.5%7.21218108.714小鼠常见高自发性肿瘤举例小鼠常见高自发性肿瘤举例182.1概述概述l诱发性肿瘤的因素主要包括化学因素（例如各种化学物质、毒素等）、物理因素（如放射线）和生物因素（如病毒）。l诱发肿瘤的方法包括口服法、注射法、涂抹法、植入法、辐照法等。诱 癌 物方 法动物肿瘤类型甲基胆蒽甲基苄基亚硝胺4-二甲基氨基偶氮苯黄曲霉毒素B1二乙基亚硝胺苯并芘+三氧化铁二亚硝基哌嗪植入（棉线穿入）灌胃饲喂饲喂皮下注射气管灌注皮下注射
15、小鼠小鼠大鼠大鼠小鼠仓鼠大鼠食管癌胃癌肝癌肝癌肺癌肺癌鼻咽癌常见的动物诱发肿瘤模型举例常见的动物诱发肿瘤模型举例192.1概述概述l诱发肿瘤的特点诱发肿瘤的特点是基本符合人类肿瘤发病的过程，造模时间较长，发病率接近100%，但是，肿瘤组织类型较为复杂（不单纯，各种组织类型或各部器官的肿瘤同时存在于一只动物体内或一群动物不同个体内）。l动物移植性肿瘤动物移植性肿瘤来自于自发或诱法的肿瘤，经过体内传代培育而成的实验动物肿瘤模型。它的特点是肿瘤接种的成功率为100%，可在同一时间内获得大量生长均匀的肿瘤，肿瘤组织学类型单纯，接种肿瘤的动物成模时间短，可以在短时间内对药物的生物活性做出评价。一般而言，
16、药物抗肿瘤活性的筛选主要选择使用移植性肿瘤模型 202.2动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种 l2.2.1动物的选择动物的选择l动物的选择中主要包括动物的种类、品系、体重、性别等。l（1）种类l使用较多的是小鼠和大鼠，而小鼠的使用占有绝对的优势。l（2）品系l根据肿瘤（瘤株）的不同选择不同品系的动物。21不同瘤株对实验动物品系的要求不同瘤株对实验动物品系的要求肿瘤名称与类型代号所需动物（宿主）艾氏腹水癌肝癌腹水型肉瘤180肉瘤180腹水型宫颈癌肺癌肺癌乳腺癌黑色素瘤白血病白血病白血病癌肉瘤EACHep AS180S180 AU14LewisLA795MA737B16L615P388L12
17、10W256昆明种小白鼠或其它种系小白鼠同上同上同上同上C57BL/6小鼠AT739小鼠津白小鼠C57BL/6小鼠615小白鼠DBA/2小白鼠同上Wister大白鼠或其它种系大白鼠222.2动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种l（3）体重l小鼠的体重18至22克，具体实验时，体重最好控制在1克以内（实际工作中一般为1克）。l大鼠的体重应该在50至100克。具体实验时，体重最好控制在5克之内（实际工作中一般为5克）。l（4）性别l动物的性别一般没有特别的要求，某些特殊的肿瘤，例如乳腺癌、卵巢癌等则考虑使用雌性动物。232.2动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种l2.2.2移植瘤的接种（肿
18、瘤的移植）移植瘤的接种（肿瘤的移植）l（1）接种的一般要求。在无菌条件下完成接种的实验操作。肿瘤组织的污染往往是肿瘤接种失败的主要原因，所以应该特别引起注意。l（2）实体瘤瘤块的制备（瘤块接种法）。7至10天的荷瘤动物，肿瘤生长及动物生长状况良好。切取肿瘤组织，剪成2至3 立方毫米的小块，塞入套管针中，接种于动物的右侧腋窝皮下，从肿瘤组织取出至接种完毕应该在30分钟内完成。l（3）瘤细胞悬液的制备（细胞悬液接种法）取出的肿瘤组织剪成小块，放入玻璃的组织匀浆器中，按照肿瘤组织（g）生理盐水（mL）=13 14。制备细胞悬液，按照0.2mL/只进行接种。全部操作的时间控制在30分钟之内。242.2
19、动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种l（4）腹水型肿瘤细胞悬液的制备（腹水型瘤源接种法）主要操作包括抽取腹水。细胞计数，载玻片推片，瑞氏或基姆萨染色，分类计数，要求肿瘤细胞数的比例不小于95%。将腹水用生理盐水稀释10 100倍，以拒染法计数活细胞的比例，要求活细胞数不少于95%。接种，将稀释好的腹水细胞悬液接种于动物的腹腔（0.1 0.2mL/只）或接种于皮下（0.2mL/只），全部操作（取出腹水至肿瘤接种完毕）要求在60分钟内完成。l（5）白血病株的接种 腹水型的白血病例如L1210和P388的接种方法与腹水型肿瘤的接种方法相同。L615小鼠白血病的接种方法是：摘取脾脏，制备组织匀浆；
20、细胞计数，将细胞浓度调整为4107个/mL；接种，每只动物皮下接种细胞悬液0.1 0.2mL。252.3移植性动物肿瘤的质量鉴定移植性动物肿瘤的质量鉴定 l（1）每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查。l（2）定期进行细菌培养检测，以鉴别污染情况。l（3）肿瘤生长潜力的检查。26下述情况判断为肿瘤生长不良：下述情况判断为肿瘤生长不良：l实体瘤 l小鼠20%的肿瘤重量小于0.4克，或平均瘤重小于1克；l大鼠肿瘤平均重量小于2克。l腹水型肿瘤 l荷瘤动物生存期超出范围（不同肿瘤生存期不同）仍然存活；l经过一定的稀释接种之后无肿瘤生长。l（4）瘤株相容性的鉴别l（5）死亡分析 l（5）阳性对照药品对肿
21、瘤生长的作用l考察动物移植肿瘤对临床常用化疗药物的敏感性，观察肿瘤细胞是否出现耐药。27附表：临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性附表：临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性 药物名称P388L1210S180AEACL615ESCS180HepB16U14W256米妥蒽醌5-氟尿嘧啶阿糖胞苷环磷酰胺秋水仙碱长春新碱喜树碱钠丝裂霉素阿霉素紫杉醇顺铂282.4待筛样品的制备待筛样品的制备l样品制备过程中应该注意的问题：l对于化学性能不稳定的样品一定要新鲜配置，对于化学性能是否稳定不清的样品应该按照不稳定来处理。l对于水溶性较差的样品应该采用某些助溶剂尽可能使其溶解成为真溶液，特别是给药途径为注
22、射给药时。灌胃给药者可以配制成混悬液。选择溶解方法时应该考虑对机体不应产生不良反应。l在实验室中配置好的样品一般均为4（冰箱）保存。l生物制剂样品一般均需要低温保存，同时还要避免反复冻融，因此，样品配制过程中应该考虑进行适当的分装。l需要避光保存的样品因该使用棕色器皿。292.5剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量l2.5.1剂量的选择剂量的选择l为了对样品的生物活性做出十分客观的评价，就必须保证在筛选实验中剂量要给足，对于细胞毒类药物一般是最大耐受剂量（动物可以耐受的，不至产生明显毒性反应的剂量）。给药剂量的设计一般有以下几种方法：l（1）依据样品的毒性资料设计给药剂量l如果
23、已知样品的LD50可以考虑使用1/3 1/5的LD50作为给药剂量（1次/日），或者以LD5或LD10作为给药剂量。l如果不知道样品的LD50，动物实验摸索，找到可至动物全部死亡的最小剂量和可使动物全部存活的最大剂量。以可至部分动物死亡的剂量的1/5 1/3或1/10 1/5作为治疗剂量。应该注意的是，细胞毒类药物的致死作用往往表现的很迟缓，因此，给药后观察的时间要够长，至少要观察1周。l样品本身毒性很小，无法测定其致死剂量时。采取最大浓度药液的最大允许给药容积给药。30大、小鼠各种途径最大允许给药容积大、小鼠各种途径最大允许给药容积l供参考，实际实验中可有差异。若注射剂为油剂时，容积均为0.
24、2mL。动 物各种途径最大允许给药容积（单位：mL）igipsc小鼠（20g）大鼠（100g）0.83.01.03.01.03.0312.5剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量l（2）结合筛选（预）实验设计给药剂量l合成药物或天然药物提取成分可以考虑先试用500mg/kg的剂量，疗程结束时，若动物死亡率超过34%，并且没有见到明确的抗肿瘤活性，则认为该药没有继续实验的价值，停止实验。若见到抗肿瘤效果但动物死亡超过34%，则可按照下表减低剂量，进一步实验。32确定动物治疗剂量简表确定动物治疗剂量简表 动物死亡率（%）下一步实验剂量0 3435 7576 100100（24小时之内
25、）不变乘以0.5乘以0.25乘以0.233常用化疗药物的常用化疗药物的LD50、LD10及实验参考给药剂量及实验参考给药剂量药物名称LD50（mg/kg）LD10（mg/kg）单次剂量（mg/kgd）米妥蒽醌5-氟尿嘧啶环磷酰胺秋水仙碱长春新碱喜树碱钠丝裂霉素C阿霉素紫杉醇顺铂卡铂15（iv）1854722.36.56.88.4（iv5）14.2131.592.62.021.959104.051、1.5、2、315、20、258、20、30、50、100、1500.3、0.4、1、20.1、0.2、1、2.20.6、1、4、81、1.5、21.25、1.5、2、2.52.6、4.3、7.2、1
26、20.5、1、210、20、30342.5剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量l（3）给药次数的确定l一般给药次数多为每日一次，连续7 10天，但是根据具体情况也可以调整为间隔给药或每日多次给药。352.5剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量l2.5.2动物分组动物分组l一般筛选实验主要设立对照组（给予生理盐水），不同剂量的各 给药组，阳性药品对照组。必要的时候还要设置赋形剂（溶媒）对照组。除对照组之外，一般每组动物数为8 10只，如果选择近交系小鼠作为实验对象，由于近交系动物的遗传特点，可以适当减少动物每组数量，例如每组6 8只。对照组的动物数量应该多于实验组
27、，对照组的动物数可以根据下述公式进行计算：l对照组动物数=试验组动物数(组数)1/2l 动物分组应该按照随机的原则，另外需要注意的是，如无特殊要求或实验处理，荷瘤动物的分组应该在动物全部接种完毕后进行。362.6疗效评价疗效评价l（1）实体瘤疗效的评价l依据给药方案的不同，可于停药后次日（给药7 10次）或停药后数日（例如单次给药），估计对照组动物肿瘤生长良好（依肿瘤类型不同，一般在肿瘤接种后1 2周）时，处死动物。先称取体重，后解剖皮下瘤块，称取肿瘤重量。l出现下述情况，实验结果应判断为无效，需要重新试验：l对照组小鼠平均瘤重小于1克，或20%小鼠瘤重小于0.4克；大鼠肿瘤平均瘤重小于2克。
28、均表示肿瘤生长不良。l治疗期间，给药组动物死亡超过20%，或平均体重（去除肿瘤后）下降（自身对照）超过15%者，提示药物毒性反应。372.6疗效评价疗效评价l实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率（肿瘤生长抑制率）表示，其计算公式如下：l肿瘤生长抑制率肿瘤生长抑制率=（1T/C）100%lT：治疗组平均肿瘤重量。lC：对照组平均肿瘤重量l根据经验，一般认为天然产物（中草药）提取物（粗提物）的肿瘤生长抑制率超过30%，合成药物的肿瘤生长抑制率超过40%，且具有统计学意义，认为该样品具有一定的价值，可以继续重复实验（两次），若结果稳定，则判断该样品具有抗肿瘤活性。382.6疗效评价疗效评价l（2）腹水型肿瘤
29、的疗效评价l一般在给药治疗结束后次日开始逐日称取每只动物的体重并纪录，对照组动物通常在2 3周内全部死亡，个别存活时间过长者需要将其剔除，这时，其它所有实验组的动物均需相应的剔除。l出现下述情况，实验结果应判断为无效，需要重新试验：l治疗期间对照组动物在7天之内死亡率大于或等于20%，表示试验失败。l对照组动物存活4周以上者超过或等于20%，亦表示试验失败。392.6疗效评价疗效评价l腹水型肿瘤的疗效评价以动物生命延长率表示，生命延长率的计算公式如下：l生命延长率生命延长率=（T/C1）100%lT：治疗组平均生存时间lC：对照组平均生存时间l（注：治疗组动物观察时间为60天，存活时间超过60
30、天者，按照60天计算。）l一般认为，非腹腔给药时，生命延长率超过50%，或者腹腔给药时，生命延长率超过75%，经统计学检验具有显著型差异，则该样品可能具有进一步试验的价值，需要继续重复试验。连续3次，疗效稳定者，则判断该样品具有抗肿瘤的活性。402.6疗效评价疗效评价l（3）白血病的疗效评价l基本上与腹水型肿瘤的疗效评价相同，以生命延长率作为评价指标。l（4）抗肿瘤药物药效学评价的三段式序贯设计l为了降低试验成本，可根据统计学原理，采用三段式序贯设计。如果某一样品能够顺利通过三阶段试验所规定的疗效标准，则可判断为该样品具有抗肿瘤活性，否则将被淘汰。l三段式序贯设计对于实体瘤而言，以肿瘤的重量作
31、为评价指标，计算T/C的比值，即治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重。对于腹水型肿瘤或白血病而言，以动物的存活时间（天数）为评价指标，那么T/C的含义就是治疗组动物平均生存天数/对照动物平均生存天数，该试验设计选择继续试验还是淘汰的要求见下表：41序贯试验之实体瘤治疗序贯试验之实体瘤治疗/对照比值表对照比值表 合成化合物天然产物放弃继续放弃继续第一次试验（T/C）0.540.540.450.45最初二次试验（T/C）1（T/C）2乘积0.2乘积0.2乘积0.2乘积0.2最初三次试验（T/C）1（T/C）2（T/C）3乘积0.08乘积0.08如果以生存时间来表示：第一次试验（T/C）大于或等于1.25
32、；最初二次试验（T/C）1（T/C）2大于或等于1.56；合成化合物与天然产品均等同。422.7瘤株的选择瘤株的选择l2.7.1常用瘤株的介绍常用瘤株的介绍常见动物移植性肿瘤瘤株名 称代号来 源 与 类 型艾氏腹水癌肉瘤180白血病P388Lewis肺癌结肠癌26瓦克256吉田肉瘤M5076肉瘤EACS180P388W256M5076小鼠自发性乳腺癌。雄性小鼠腋窝部多形型细胞肉瘤。甲基胆蒽涂抹小鼠诱发的淋巴细胞白血病。小鼠自发的肺部未分化上皮样癌。N-甲基-N-亚硝基乌拉坦诱发的小鼠腺癌。怀孕大白鼠乳腺部位的自发肿瘤。氨基偶氮苯与砷化钾诱导大鼠阴囊部肿瘤。雌性小鼠卵巢自发的纤维肉瘤。432.7
33、瘤株的选择瘤株的选择l2.7.2瘤株的选择瘤株的选择l用一种模型去筛选各种不同类型的新药，显然是不恰当的，因为各种动物的移植瘤对抗肿瘤药物的敏感性是不同的。l筛选烷化剂可选用吉田肉瘤、W256；l筛选抗代谢药物时，可以用S180、L615及L1210；l筛选天然产物抗肿瘤药物可选用P388、L615、EAC、U14等。l一般认为，初筛时应该选择三种组织类型不同的肿瘤，即肉瘤（实体瘤）、腹水性肿瘤和白血病。442.8举例举例l一份完整的实验报告中要包括样品名称、批号、来源、给药方案、实验设计人、试验操作人、报告审核人、所用的瘤株及试验日期。l报告实验内容包括：实验开始与结束时的动物数量，动物体重
34、，重瘤重量（生存时间）等。45举例举例某些样品对小鼠肝癌某些样品对小鼠肝癌Hep S生长生长抑制作用筛选试验的结果抑制作用筛选试验的结果 样品名称(组别)动物数（只）动物体重（g，XS）肿瘤重量（g，XS）抑瘤率（%）P值试验开始试验结束试验开始试验结束生理盐水样品A样品B样品C样品D141010101012101081021.081.0021.201.1421.091.0021.090.9421.160.9527.953.6825.152.3127.522.2217.941.6826.243.262.760.690.550.382.030.370.230.172.450.4680.0726.
35、4591.6711.230.0010.010.0010.05样品名称：批号：来源：给药方案（剂量、途径、次数）：实验设计：试验操作：报告审核试验日期：年 月 日至 年 月 日 462.9人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型l（1）原理l裸鼠又称无胸腺小鼠，具有以下4个特点：先天性胸腺缺如；胸腺依赖性免疫功能缺乏，其T细胞功能接近于零，但B细胞功能大致接近正常；人体肿瘤异种移植时无排斥反应，故可供人体肿瘤移植。且肿瘤移植后保持其原有的功能，组织形态，免疫学特点以及染色体组型和对抗肿瘤药物原有的敏感性。裸鼠因皮肤裸露，操作方便，易于动态观察肿瘤的生长。l（2）方法l可以选择已经
36、建株的人的肿瘤细胞，也可以选择新鲜的肿瘤组织，为了方便起见，以选用前者为最多见，移植材料可以来自生长于裸鼠的肿瘤瘤块，也可以来自经过培养肿瘤细胞悬液，前者按照瘤块接种法接种，后者用细胞悬液接种法接种。待肿瘤明显生长（大约超过100mg）后分组给药。472.9人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型l（3）评价l与小鼠实体肿瘤评价方法相同，以肿瘤生长抑制率表示。l（4）注意事项l使用人体肿瘤异种移植模型应该注意以下事项：目前认为人体裸鼠异种移植模型对抗肿瘤药物的反应与临床上的治疗反应基本平行，对临床疗效有较好的预告价值；裸鼠饲养环境要求严格，繁殖比较困难，试验成本昂贵；裸鼠对药物
37、毒性的敏感性与普通小鼠相似。483样品抗肿瘤活性的确证（二）样品抗肿瘤活性的确证（二）体外筛选实验体外筛选实验l抗肿瘤药物的体外筛选试验（细胞试验）是一种重要的药物筛选手段。它具有快速、灵敏、所需样品节省、实验成本低等特点。如果样品可以和肿瘤细胞直接接触而发挥作用其实验结果与临床的治疗效果会有较好的符合性。l抗肿瘤药物的筛选研究中细胞试验的内容非常丰富的，已经培育了大量的的肿瘤细胞株，。这一特点也取决于肿瘤细胞本身所固有的生物学特性肿瘤细胞的“不死性”。493.1原理与基本操作要点原理与基本操作要点l3.1.1实验原理实验原理l 采用组织培养技术，可以在体外条件下建立具有不死性的、可以无限传代
38、的肿瘤细胞系。应用这些肿瘤细胞株进行抗肿瘤药物的筛选实验及作用机制的探讨，发现新的活性物质，是药物研究的重要手段。肿瘤细胞试验技术操作的主要内容就是细胞的培养技术，它们包括细胞的培养、传代和保存。503.1原理与基本操作要点原理与基本操作要点l3.1.2基本操作要点基本操作要点l（1）肿瘤细胞的培养l严格无菌操作，污染是细胞培养失败的首要原因。必要时可以使用抗菌素，常用的抗菌素是青霉素与链霉素。l适宜的温度。一般均为37。l适宜的酸碱度。应将pH控制在7.0 7.4的中性范围内。l提供细胞生长所需的营养条件。以合成培养基和小牛血清（或胎牛血清）按照一定比例混合后使用。不同的肿瘤细胞所需的培养基
39、可能是不同的。51不同肿瘤细胞对培养基的要求举例不同肿瘤细胞对培养基的要求举例 代号组织类型所需培养基MELHL-60K562MCF-7A549小鼠红白血病人早幼粒性白血病人慢粒性白血病人乳腺癌人非小细胞肺癌Hams F12，也可用MEM、164016401640MEM或1640Dulbecco MEM523.1原理与基本操作要点原理与基本操作要点l（2）肿瘤细胞的传代l肿瘤细胞在培养一定的时间后，将逐渐占据整个培养空间，这时候就需要传代，以免因生存空间不足或细胞密度过大引起营养枯竭而影响细胞生长。l肿瘤细胞因其组织类型或组织来源不同，具有贴附性生长（贴壁生长）和悬浮性生长两种状态，前者主要见
40、于上皮及间质性来源的细胞，后者主要见于白血病来源的细胞。贴壁性生长的细胞与悬浮性生长的细胞传代与培养的操作有所不同，其最大的差别在于，前者在操作中需要使用消化液（胰蛋白酶或EDTA）对细胞进行处理，使其脱壁。后者则无需此步操作。533.1原理与基本操作要点原理与基本操作要点l（3）肿瘤细胞的冻存与复苏l细胞冷冻保存是将细胞冻存在液态氮中，温度达-196，其贮存时间几乎是无限的。l细胞冻存与复苏操作的技术要点有：l细胞冻存复苏的基本原则是“慢冻快融”。l冻存应选取对数生长期增殖旺盛的细胞。l冻存时应加入细胞保护剂DMSO（二甲基亚砜）或甘油。l细胞中加入这些保护剂，可使冰点降低，使得冻结前细胞内
41、水分透出细胞外，减少冰晶形成，从而达到保护细胞的目的。l冻存的细胞最好每年复苏一次，以保证细胞活力。543.2常用的肿瘤细胞株介绍常用的肿瘤细胞株介绍l常用肿瘤细胞株概要常用肿瘤细胞株概要 细胞株名称来 源生 物 学 特 点研究应用MEL红白血病细胞HL-60白血病细胞K562白血病细胞WEHI-3B白血病细胞B-16黑色素瘤细胞A2780卵巢癌细胞MCF-7乳腺癌细胞KB口腔癌细胞A549肺癌细胞HT1080纤维肉瘤细胞3T3-L1成纤维细胞NB4白血病细胞DBA/2小鼠白血病人白血病人BALB/C小鼠C57BL/6小鼠卵巢癌病人乳腺癌病人口腔癌病人肺癌病人纤维肉瘤病人3T3-小鼠白血病人悬
42、浮培养，小细胞，球状基本为二倍体，有染色体异常细胞较大，酸性磷酸酶阳性，基本为三倍体，Ph染色体阳性培养条件不适可影响分化诱导的敏感性，密度高过会自分化高、低密度时细胞形态有变化，可移植到动物体内对阿霉素及苯丙氨酸氮芥敏感上皮样生长单层上皮样生长上皮样生长上皮样生长，倍增时间较长，26小时非典型的肿瘤细胞，达到饱和浓度时有接触性抑制具有人早幼粒细胞白血病所特有的、典型的染色体异常分化诱导实验分化诱导实验分化诱导实验，耐药分化诱导实验分化诱导或细胞杀伤实验细胞杀伤及耐药实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤及抗侵袭实验分化诱导或细胞杀伤实验分化诱导实验553.3抗肿瘤药物体外筛选的实验
43、设计抗肿瘤药物体外筛选的实验设计l（1）细胞种类的选择l样品初筛时应该注意三点：兼顾选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞；筛选实验以快速生长的细胞为主；兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞。lMTT法由于具有微量、快速、灵敏的特点，已经成为样品初筛使用最多的方法，而这种方法比较适宜生长快速的细胞，细胞经过2 4天的培养，即可分析结果，因此目前主张生长速度较慢的细胞放到体内复筛实验中。563.3抗肿瘤药物体外筛选的实验设计抗肿瘤药物体外筛选的实验设计l（2）待筛样品的浓度l根据工作经验，一般认为，对于化学合成物或天然产物的提取物初筛时可以选择100、10、1g/mL三个浓度；对于粗制发酵液则
44、可采用110、1100、11000三个稀释度。l测定ED50或IC50时，至少应该设置5个浓度，浓度间隔可采用等比间隔，例如：1、2、4、8、16或0.01、0.1、1、10、100。如果知道化合物的分子量，可以使用克分子浓度表示，美国NCI现用的浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。l（3）样品与细胞相互作用的时间l目前常见的样品与细胞相互孵育的时间有1小时和24小时以及持续作用3 7天等。在实际工作中，为了保证有活性的样品不被落筛，所以可以考虑初筛时采用持续药物作用，初筛通过的样品可以进一步观察其时-效关系。57l（4）实验体系中的细胞密度（数量）lNCI抗肿瘤
45、药物筛选部分人肿瘤细胞株接种密度（抗肿瘤药物筛选部分人肿瘤细胞株接种密度（MTT法）法）细胞株细胞/孔（103）细胞株细胞/孔（103）肺癌肺癌NCI-H23NCI-H460NCI-H522A549/ATCC肾癌肾癌UO-31SN12C结肠癌结肠癌HT-29HCC2998SOLO205 KM20L2HCT-1162051510201551015105黑色素瘤黑色素瘤LOXMV1SK-MEL-2CNS肿瘤肿瘤SNB-19SNB-75U251卵巢癌卵巢癌OVCAR-3SK-OV-3白血病白血病CCRF-CEMK562HL-6052015207.5102040520583.4常用的评价方法常用的评价
46、方法l3.4.1细胞拒染法细胞拒染法l原理原理 亦称为染料排斥实验法。活细胞具有排斥某些染料的能力，而当细胞死亡后，细胞膜的完整性破坏，细胞即被着色。实验室中常用的生物染料有胎盘兰、伊红等。通过计数的方法计算存活与死亡细胞的数量，评价药物的活性。l评价指标评价指标 以活细胞率与药物浓度的对数作图，可以画出S型剂量反应曲线，通过计算求出LD50（半数致死浓度）。l注意事项注意事项 致死性损伤所造成的细胞膜改变一般多在药物作用后34天才表现出来，过早以生物染料处理，可能会使所得的活细胞率偏高；药物若导致死亡细胞崩解，会使细胞总数减少，活细胞数量相对增多，从而使得活细胞率升高。593.4常用的评价方
47、法常用的评价方法l3.4.2生长曲线法生长曲线法l原理原理 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数性生长、增殖。取细胞数的对数与培养时间作图，即纵坐标为log细胞数，横坐标为时间（一般用天来表示），可以得到一条斜率向上的直线。随着培养时间的延长，细胞密度不断增加，由于营养物的耗竭和代谢产物的积聚，细胞增长速度逐渐减慢以致停滞，生长曲线的斜率逐渐变成水平，此时达到高坪期，药物对细胞生长的影响能够通过生长曲线反映出来。l评价指标评价指标 药物对增殖细胞的杀伤率。药物对细胞倍增时间的影响。药物对细胞生长饱和密度的影响。l注意事项注意事项 本评价方法更加适合用于悬浮培养细胞，因为悬浮培养的细胞可以连续
48、取样作细胞计数，贴壁生长的细胞则需要消化后才能计数，实验设计较为复杂，需要作出多份培养。603.4常用的评价方法常用的评价方法l3.4.3克隆计数法克隆计数法l原理原理 亦称为集落形成法。克隆原细胞（clonogenic cell）也叫做干细胞（stem cell），指具有持续分裂增殖能力的细胞。肿瘤组织的生长、转移、浸润、复发均以克隆原细胞的增殖为基础。当单个细胞连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）便含50个以上细胞，当在培养物或培养基中接种的细胞比较稀疏时，每个增殖形成的集落彼此不接触，这样就可以通过计数对克隆原细胞作定量分析。而克隆原细胞数能够反映单个细胞的增殖潜力，因此能够
49、较为灵敏的检测样品的抗肿瘤活性，克隆计数法在抗肿瘤药物筛选中被认为是一种较为敏感的方法。依据使用中选择细胞的不同，克隆计数法分为贴壁法和半固体培养基法。613.4常用的评价方法常用的评价方法l评价指标评价指标 样品对癌细胞增殖的半数抑制浓度IC50。集落细胞存活曲线法。计算出反映细胞对样品敏感性的D0值，计算出反映细胞损伤修复能力的n值。l注意事项注意事项 对照组集落形成率应该在40%60%左右；本实验方法采用的是药物持续作用法，所以如果需要观察测定样品作用时间与活性之间的关系，可以通过先用样品以不同作用时间处理细胞，清洗后再作本实验；对于能够贴壁生长的细胞采用普通液体培养就可以，对于悬浮生长
50、的细胞，则需要采用半固体琼脂培养基进行培养，所以就本方法而言，更适于筛选贴壁生长细胞。623.4常用的评价方法常用的评价方法l3.4.4MTT法法l这是一个重要的方法，是目前抗肿瘤药物筛选甚至其它药物筛选使用最多的主流方法，这种方法上个世纪80年代建立于美国NCI。l原理原理 该方法以代谢还原3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT，四甲基偶氮唑盐，噻唑兰）为基础。活细胞的线粒体中存在着琥珀酸脱氢酶，该酶可以将黄色的MTT还原成为不溶性的蓝紫色的甲臢(Formazan)颗粒，死细胞该酶活性丧失，无法还原MT
