1、第五章第五章 免疫免疫凝集试验凝集试验 (agglutination (agglutination test)test)定义：定义：颗粒性抗原颗粒性抗原(可溶性抗原与载体颗粒可溶性抗原与载体颗粒结合成致敏颗粒后结合成致敏颗粒后)与与相应抗体相应抗体发生发生特特异性异性反应，在适当反应，在适当电解质电解质存在下，形成存在下，形成肉眼肉眼可见可见的的凝集块凝集块。第一节第一节 概述概述 发生机制：发生机制：特异性；分两阶段进行。特异性；分两阶段进行。IgM的凝集作用的凝集作用IgG。不完全抗体：不完全抗体：与相应抗原结合，但不形与相应抗原结合，但不形 成可见的凝集现象。成可见的凝集现象。主要为主要
2、为IgG类抗体。类抗体。凝集反应的类型：凝集反应的类型：直接凝集反应。直接凝集反应。间接凝集反应。间接凝集反应。Coombs试验。试验。凝集反应的应用：凝集反应的应用：抗原或抗体的抗原或抗体的定性定性检测检测 抗体的抗体的半定量半定量检测检测第二节第二节 直接直接凝集反应凝集反应（direct agglutination testdirect agglutination test）定义定义：颗粒性抗原颗粒性抗原+相应抗体相应抗体肉眼可见的凝集块肉眼可见的凝集块 其中的抗原其中的抗原(agglutinogen)：凝集原凝集原(细菌细菌,RBC等等)抗体抗体(agglutinin)：凝集素凝集素
3、常用方法常用方法：玻片法：玻片法：试管法：试管法：微量血凝反应板法：微量血凝反应板法：直接凝集反应直接凝集反应凝集原凝集原凝集素凝集素一、玻片凝集试验一、玻片凝集试验(slideagglutination test)玻片法玻片法：定性定性试验。试验。常用常用已知已知AbAb，测定，测定未知未知AgAg(待检样本待检样本)。结果判读：结果判读：已知已知AbAb 未知未知AgAg 凝集，阳性凝集，阳性(+)(+)。不凝集，阴性不凝集，阴性(-)(-)。方法评价：方法评价：特异性强特异性强;简便、快速简便、快速;敏感度敏感度低低。应用：应用：ABO血型鉴定。血型鉴定。细菌的鉴别与分型细菌的鉴别与分型
4、。抗抗 A抗抗 B1.已知抗体已知抗体2.未知抗原未知抗原 (待检待检RBC)3.结果：结果：不凝集不凝集4.结论：结论：凝集凝集 受检者血型为：受检者血型为：A型型ABO血型的鉴定血型的鉴定细菌的鉴别 材料：玻片1张/1人，待检菌，已知诊断血清，接种环 方法：轻摇玻片，12分钟后观察 结果判定：出现乳白色凝集块属阳性反应 结论：待检菌为？NS待检菌诊断血清NS待检菌二、试管凝集试验二、试管凝集试验(tube agglutination test)试管法试管法：半半定定量量试验。试验。常用常用已知已知AgAg，测定，测定未知未知 Ab Ab(待检血清待检血清)。方法评价：方法评价：特异性易受影
5、响；特异性易受影响；敏感性不高。敏感性不高。应用：应用：多用以测定多用以测定抗体的含量抗体的含量（效价、滴度效价、滴度）。）。肥达氏反应肥达氏反应、外斐氏反应外斐氏反应、交叉配血试验交叉配血试验。0.50.50.50.50.50.5 0.50.50.50.5弃掉弃掉0.50.5 试管凝集试验原理结结果果 1 2 3 4 5 6 7菌液菌液 结果观察：结果观察：观察管底是否有凝集现象。观察管底是否有凝集现象。完全凝集（）完全凝集（）：凝集块完全沉于管底，液体澄清。：凝集块完全沉于管底，液体澄清。75%75%凝集（）凝集（）：凝集块沉于管底，液体稍混。：凝集块沉于管底，液体稍混。50%50%凝集（
6、）凝集（）：凝集块沉于管底，液体混浊。：凝集块沉于管底，液体混浊。以上结果均为以上结果均为阳性阳性，均出现，均出现肉眼明显可见的凝集肉眼明显可见的凝集。25%25%凝集（弱阳性）凝集（弱阳性）：液体混浊。：液体混浊。阴性：阴性：无变化。无变化。结果判读：结果判读：以产生以产生明显凝集明显凝集现象（现象（“”）的的最最高稀释度高稀释度作为作为AbAb的效价（含量）。的效价（含量）。间接凝集试验：间接凝集试验：用人工方法将可溶性抗原用人工方法将可溶性抗原(或或 抗体）抗体）吸附或偶联于载体吸附或偶联于载体上，使之成为上，使之成为致敏致敏 载体颗粒载体颗粒，再与相应抗体（或抗原）作用，再与相应抗体（
7、或抗原）作用，在适宜电解质的参与下，出现的凝集现象。在适宜电解质的参与下，出现的凝集现象。优点：优点：敏感度比直接凝集反应敏感度比直接凝集反应高高 2 28 8倍倍，亦亦明显高于沉淀反应。明显高于沉淀反应。第三节第三节 间接凝集反应间接凝集反应(indirect agglutination test)(indirect agglutination test)载体载体(carrier):(carrier):试验体系中试验体系中与免疫无关与免疫无关的颗粒。的颗粒。对载体的要求：对载体的要求：不溶于水，在不溶于水，在NSNS中性质稳定，无化学、血清学活性。中性质稳定，无化学、血清学活性。大小均一，短
8、时间内不致下沉。大小均一，短时间内不致下沉。能够直接吸附或偶联抗原或抗体，且不影响其活性。能够直接吸附或偶联抗原或抗体，且不影响其活性。致敏：致敏：抗原抗原(或抗体或抗体)偶联于颗粒表面的过程。偶联于颗粒表面的过程。致敏颗粒致敏颗粒（sensitized particle):吸附有已知抗吸附有已知抗 原或抗体的颗粒。原或抗体的颗粒。载体载体可溶性抗原可溶性抗原致敏致敏致敏颗粒致敏颗粒NSNS凝集颗粒凝集颗粒 间接凝集试验示意图间接凝集试验示意图 一、常用载体种类及其处理方法一、常用载体种类及其处理方法红细胞：红细胞：新鲜红细胞吸附蛋白质的能力差。一新鲜红细胞吸附蛋白质的能力差。一般先醛化后应用
9、。般先醛化后应用。聚苯乙烯胶乳颗粒聚苯乙烯胶乳颗粒：可物理吸附蛋白质；常制备带有化学可物理吸附蛋白质；常制备带有化学活性基团的颗粒。活性基团的颗粒。活性炭：活性炭：SPASPA：二、间接凝集反应类型二、间接凝集反应类型根据致敏用的试剂和反应方式分为：根据致敏用的试剂和反应方式分为：2.2.反向间接凝集试验反向间接凝集试验(reverse indirect agglutination test)3.3.间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)1.(1.(正向正向)间接凝集试验间接凝集试验（indirect agglutina
10、tion test)4.4.协同凝集试验协同凝集试验(coagglutination test)载体载体可溶性抗原可溶性抗原致敏致敏致敏颗粒致敏颗粒NSNS凝集颗粒凝集颗粒 （正向）间接凝集试验（正向）间接凝集试验用特异性用特异性抗原致抗原致敏载体敏载体，检测标，检测标本中的相应抗体本中的相应抗体的方法。的方法。待测抗体待测抗体结果判读：凝集，阳性(+)。不凝集，阴性(-)。反向间接凝集试验反向间接凝集试验用特异性用特异性抗体抗体致敏载体致敏载体，检，检测标本中的相测标本中的相应抗原的方法。应抗原的方法。载体载体已知抗体已知抗体致敏致敏致敏颗粒致敏颗粒NSNS凝集颗粒凝集颗粒待测抗原待测抗原结
11、果判读：凝集，阳性(+)。不凝集，阴性(-)。间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验待测抗原待测抗原已知抗体已知抗体特异特异结合结合抗原抗体复合物抗原抗体复合物NSNS致敏颗粒致敏颗粒用用抗原致敏载体及相抗原致敏载体及相应抗体应抗体作为诊断试剂，作为诊断试剂，用于检测标本中是否用于检测标本中是否存在与致敏载体相同存在与致敏载体相同的抗原。的抗原。无凝集颗无凝集颗粒为粒为 间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验待测抗原待测抗原已知抗体已知抗体无结合无结合抗原抗体分散抗原抗体分散NSNS致敏颗粒致敏颗粒有凝集颗有凝集颗粒为粒为 原理原理协同凝集试验协同凝集试验 SPASPA能与血清中的能与血清中的IgGIgG
12、类类抗体的抗体的FcFc段非特异性结合段非特异性结合，而两个而两个FabFab段暴露在葡萄球段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍然保持正菌菌体表面，仍然保持正常的抗体活性，与特异性常的抗体活性，与特异性抗原相遇时，能出现特异抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。的凝集现象。应用应用微生物的快速微生物的快速诊断、定种及诊断、定种及定型；以协助定型；以协助传染病的早期传染病的早期诊断。诊断。原理图原理图IgGSPASPA-IgG 待测抗原待测抗原SPA-IgG-待测抗原待测抗原凝集颗粒凝集颗粒混混合合 加入加入 原理原理二、间接血凝试验二、间接血凝试验(被动血凝试验被动血凝试验)将可溶性抗原将可溶性抗原(或抗
13、或抗体）体）吸附人的吸附人的“O”“O”型血型血红细胞或绵羊或家兔的红细胞或绵羊或家兔的红细胞红细胞，制成致敏血红，制成致敏血红细胞细胞,与相应抗体（或抗与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解原）作用，在适宜电解质参与下，出现红细胞质参与下，出现红细胞凝集现象。凝集现象。RBC为载体：动物，或人的“0”型血RBC醛化红细胞：用戊二醛处理，成团，不易摇散；吸附大，耐温，耐冻融。致敏红细胞保存时间短，易变脆、溶血、被污染，因此在致敏前醛化。致敏醛化红细胞：用Ag/Ab直接或化学联结，与RBC作用，吸附于RBC的过程。（indirect hemagglutination test)红细胞红细胞抗原抗原
14、致敏致敏致敏红细胞致敏红细胞NSNS红细胞凝集红细胞凝集 间接血凝试验待测抗体待测抗体 结果示意图结果示意图-+结果判断结果判断:效价？效价？方法评价：方法评价：敏感性较强、简便、快速、成本低廉敏感性较强、简便、快速、成本低廉 三、颗粒免疫凝集试验三、颗粒免疫凝集试验 胶乳颗粒凝集试验胶乳颗粒凝集试验 明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验 碳颗粒凝集试验碳颗粒凝集试验 甲苯胺红颗粒凝集试验甲苯胺红颗粒凝集试验应用应用:类风湿因子检测等类风湿因子检测等 原理原理胶乳凝集试验胶乳凝集试验 将可溶性抗原将可溶性抗原(或或抗体）抗体）与胶乳结合与胶乳结合后，后，直接与直接与待测标本待测标本中相中相应抗体（
15、或抗原）发应抗体（或抗原）发生凝集反应。生凝集反应。方法评价：方法评价：1.1.胶乳颗粒的性能比胶乳颗粒的性能比 RBC RBC稳定、均一性好稳定、均一性好 2.2.与抗原结合的能力与抗原结合的能力 及凝集性能不如及凝集性能不如RBCRBC （indirect hemagglutination test)应用应用:类风湿因子检测等类风湿因子检测等 三、颗粒免疫凝集试验三、颗粒免疫凝集试验 胶乳颗粒凝集试验胶乳颗粒凝集试验 明胶颗粒凝集试验：明胶颗粒凝集试验：抗抗HIVHIV抗体、抗精子抗抗体、抗精子抗 体检测体检测 碳颗粒凝集试验：碳颗粒凝集试验：炭疽、鼠疫、马副伤寒炭疽、鼠疫、马副伤寒性性
16、流产等诊断流产等诊断 甲苯胺红颗粒凝集试验：甲苯胺红颗粒凝集试验：献血员筛选、梅献血员筛选、梅 毒的辅助诊断毒的辅助诊断应用应用:类风湿因子检测等类风湿因子检测等 原理原理 第四节第四节 抗球蛋白红细胞免疫凝集试验抗球蛋白红细胞免疫凝集试验 (Coombs试验试验)机体受某些抗原刺激后产机体受某些抗原刺激后产生生“不完全抗体不完全抗体”，其与，其与相应抗原结合后相应抗原结合后不出现可不出现可见的凝集现象见的凝集现象，但能封闭，但能封闭抗原决定簇，使其不能再抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。与完全抗体结合。类型类型 1.1.直接法直接法 2.2.间接法间接法方法：将人球蛋白，注入异方法：将人
17、球蛋白，注入异种动物，获得种动物，获得抗球蛋白抗球蛋白。此。此种抗体加入表面结合有不完种抗体加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，全抗体的红细胞的复合物中，就能就能出现可见的凝集现象出现可见的凝集现象。是检测是检测抗红细胞不完全抗体抗红细胞不完全抗体的一种非常经的一种非常经典的方法。典的方法。RBC不完全抗体不完全抗体(IgG)RBC不凝集。不凝集。RBC不完全抗体不完全抗体(一抗一抗)抗球蛋白抗体抗球蛋白抗体(二抗二抗)RBC凝集。凝集。常用方法：常用方法：直接直接Coombs试验：检测试验：检测RBC上的不完全抗体。上的不完全抗体。间接间接Coombs试验：检测游离在血清中的不完全试
18、验：检测游离在血清中的不完全抗体。抗体。直接法直接法作用：作用：检测检测红细胞表面红细胞表面结合的不完全抗体结合的不完全抗体。临床意义：临床意义：新生儿溶血新生儿溶血症和自身免疫性溶血性症和自身免疫性溶血性贫血的诊断。贫血的诊断。RBCRBC为为RhRh+7S7S的的IgGIgG体内发生体内发生+抗抗IgGIgG体外测试体外测试抽血抽血 间接法间接法作用：作用：检测检测游离在血清游离在血清中的不完全抗体中的不完全抗体。临床意义：临床意义：输血前的交输血前的交叉配血、不相溶输血后的叉配血、不相溶输血后的抗体检测。检测母体抗体检测。检测母体 Rh Rh（D D）抗体有助于及早发）抗体有助于及早发现
19、及避免新生儿溶血症。现及避免新生儿溶血症。RBCRBC为为RhRh+不完全抗不完全抗体体?+抗抗IgGIgG体外测试体外测试第五节第五节 自身红细胞凝集试验自身红细胞凝集试验 原理、灵敏度类似于间接血凝试验。原理、灵敏度类似于间接血凝试验。基本原理是抗人基本原理是抗人O型红细胞的单克隆抗体型红细胞的单克隆抗体能与任何种血型的红细胞结合，但不引起能与任何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体连凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测
20、标本中的抗体。测标本中的抗体。区别点：区别点：RBC为为受检者新鲜受检者新鲜RBC。所用抗体为所用抗体为双功能抗体双功能抗体(即能结合红细即能结合红细胞，也能结合待检抗原胞，也能结合待检抗原)。反应特点：反应特点：1.受检标本为受检标本为全血全血，不需分离血清。，不需分离血清。2.采采手指血或耳垂血手指血或耳垂血，立刻检测出结果。，立刻检测出结果。3.已成功应用于抗已成功应用于抗HIV抗体、抗体、HBsAg的检测。的检测。概念概念 三、冷凝集试验三、冷凝集试验冷凝集素是冷凝集素是红细胞某些红细胞某些抗原的抗原的自身自身抗体抗体，只能，只能在低温时与在低温时与其相应的抗其相应的抗原结合。原结合。
21、(cold agglutination test)冷凝集反应在冷凝集反应在44时最强烈，时最强烈，红细胞凝集最明红细胞凝集最明显；温度升高后，显；温度升高后，抗原抗体复合物抗原抗体复合物解离，凝块消失。解离，凝块消失。意义意义 原理原理冷凝集素增高冷凝集素增高常见于：单核常见于：单核细胞增多症和细胞增多症和支原体肺炎。支原体肺炎。恶性淋巴瘤呈恶性淋巴瘤呈现慢性增高。现慢性增高。冷凝集试验原理冷凝集试验原理抗原决定簇隐含，不能与抗体结合抗原决定簇隐含，不能与抗体结合混混合合暴露的抗原决定簇与抗体结合暴露的抗原决定簇与抗体结合混混合合3737443737 1.1.抗体的检测抗体的检测检测细菌、病毒寄生虫感染后产生的抗体检测细菌、病毒寄生虫感染后产生的抗体自身免疫病患者的抗体的检测自身免疫病患者的抗体的检测 变态反应患者的抗体的检测变态反应患者的抗体的检测 2.2.抗原的检测抗原的检测 第六节第六节 间接凝集试验的应用间接凝集试验的应用检测甲胎蛋白（检测甲胎蛋白（AFPAFP）、）、HCGHCG等抗原等抗原 抗原因素抗原因素 抗体因素抗体因素 致敏颗粒试剂致敏颗粒试剂 血清标本血清标本 试验条件试验条件 电解质、酸碱度、温度电解质、酸碱度、温度 抗原抗体的合适比例。抗原抗体的合适比例。抗体过量前带抑制抗体过量前带抑制第八节第八节 影响免疫凝集试验的主要因素影响免疫凝集试验的主要因素
