1、高中生物高中生物选修选修1人教版人教版课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离【目标导航目标导航】1.知知道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子技术的基本原理。子技术的基本原理。2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。一、一、血红蛋白提取和分离的基本原理血红蛋白提取和分离的基本原理1凝胶色谱法凝胶色谱法(1)概概念念也称做也称做 ，是根据，是根据 的大小分离的大小分离蛋蛋白质的有效方法。白质的有效方法。分配色谱法分配色谱法相对分子质量相对分子质量(2)原理原理由由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的构成的凝胶，内部有许多贯穿的
2、 。当当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移，移动速度动速度 ，而相对分子质量，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在内部的通道，只能在 移动，路程移动，路程 ，移动速度，移动速度 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 。通道通道多孔球体多孔球体相对分子质量相对分子质量较小较小较长较长较慢较慢较大较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快分离分离2缓冲溶液缓冲溶液(1)作用作用在一定范围内，缓冲溶液能够抵
3、制外界的在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的 对对溶液溶液pH的影响，维持的影响，维持pH 。(2)配制配制由由12种种 溶解于水中配制而成，通过溶解于水中配制而成，通过 就可以得到在不同就可以得到在不同pH范围内使用范围内使用的缓冲液。的缓冲液。酸和碱酸和碱基本不变基本不变缓冲剂缓冲剂调节缓冲剂的比例调节缓冲剂的比例3电泳电泳(1)概概念念指指 在电场的作用下发生在电场的作用下发生 的过程。的过程。(2)原理原理在一定的在一定的 下。多肽、核酸等生物大分子的可解离基团下。多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上会带上 或或 ，在电场的作用下，这些带电分子会，在电场的作用下，这些带电分子会向着
4、向着 的电极移动。的电极移动。带电粒子带电粒子迁移迁移pH正电正电负电负电与其所带电荷相反与其所带电荷相反(3)作用作用电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本的差异及分子本身的身的 、的不同，使带电分子产生不同的的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中从而实现样品中 。(4)方法方法常用的电泳方法有常用的电泳方法有 和和 。测定蛋白质分子量时通常使用测定蛋白质分子量时通常使用 。大小大小形状形状迁移速度迁移速度带电性质带电性质各种分子的分离各种分子的分离琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺
5、凝胶电泳二、二、血红蛋白提取和分离的实验操作与评价血红蛋白提取和分离的实验操作与评价1蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样样品处理、品处理、纯纯化和化和 。2样品处理样品处理(1)红红细胞的洗涤细胞的洗涤采集血样，采集血样，短时间离心，吸取血浆后加短时间离心，吸取血浆后加 洗洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是液中没有黄色。目的是 ，以利于后续步骤的分，以利于后续步骤的分离纯化。离纯化。粗分离粗分离纯度鉴定纯度鉴定低速低速生理盐水生理盐水除去杂质除去杂质(2)血红蛋白的释放血红蛋白的
6、释放将洗涤好的红细胞依次加入将洗涤好的红细胞依次加入 至原血液体积、至原血液体积、40%体体积的积的 ，置于磁力搅拌器上搅拌，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水，使红细胞吸水 ，血红蛋白释放出来。，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到将搅拌好的混合液转移到 中，以中，以2 000 r/min的速度的速度 10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。步对血红蛋白的纯化。甲苯甲苯涨破涨破离心管离心管离心离心蒸馏水蒸馏水(4)透析透析取取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放
7、入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20 mmol/L的的 中中(pH为为7.0)，透析，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。磷酸缓冲液磷酸缓冲液3凝胶色谱操作凝胶色谱操作(1)凝凝胶色谱柱的制作：准备材料胶色谱柱的制作：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安安装装 。(2)凝胶色谱柱的装填。凝胶色谱柱的装填。(3)样品的样品的 。色谱柱色谱柱加入和洗脱加入和洗脱4操作提示操作提示(1)红红细胞的洗涤细胞的洗涤 、与与 十分重要。洗涤次数过十分重要。洗涤次数过少，无法除去少，无法除去 ；离心速度
8、；离心速度 和时间和时间 会使会使 等一同沉淀，达不到分离效果。等一同沉淀，达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理色谱柱填料的处理商品凝胶使用前需直接放在商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用其中的湿凝胶用 ，加速膨胀。，加速膨胀。洗涤次数洗涤次数离心速度离心速度离心时间离心时间血浆蛋白血浆蛋白过高过高过长过长白细胞白细胞洗脱液洗脱液沸水浴加热沸水浴加热(3)凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填在装填凝胶柱时，不得有在装填凝胶柱时，不得有 存在。因其能搅乱洗脱液中蛋存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的白质的 ，降低分离效果。，降低分离效果。(4)蛋白质的分离蛋白质
9、的分离如果如果 ，说明色谱柱制作成功。，说明色谱柱制作成功。气泡气泡洗脱次序洗脱次序红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动判断正误：判断正误：(1)凝胶色谱法和电泳法分别利用了蛋白质的相对分子质量的凝胶色谱法和电泳法分别利用了蛋白质的相对分子质量的大小和所带电荷性质不同实现了对蛋白质的分离。大小和所带电荷性质不同实现了对蛋白质的分离。()(2)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较小的蛋白利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较小的蛋白质因质量较小而运动速度更快。质因质量较小而运动速度更快。()(3)缓冲液的作用是抵制外界的酸和碱对溶液缓冲液的作用是抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响
10、。的影响。()(4)电泳过程中蛋白质的运动速率只与带电性质有关。电泳过程中蛋白质的运动速率只与带电性质有关。()(5)洗涤红细胞和血红蛋白的释放所用的液体分别是生理盐水洗涤红细胞和血红蛋白的释放所用的液体分别是生理盐水和蒸馏水。和蒸馏水。()答案答案(1)(2)(3)(4)(5)一、蛋白质分离的方法一、蛋白质分离的方法1蛋蛋白质分离的依据白质分离的依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。和力等，可以用来
11、分离不同种类的蛋白质。2凝胶色谱法凝胶色谱法相对分相对分子质量子质量直径大小直径大小运动方式运动方式运动运动速度速度运动运动路程路程洗脱次序洗脱次序大大大于凝胶颗大于凝胶颗粒空隙直径、粒空隙直径、被排阻在外被排阻在外面面垂直向下垂直向下移动移动较快较快较短较短先从凝胶先从凝胶柱洗脱出柱洗脱出来来小小小于凝胶颗小于凝胶颗粒空隙直径，粒空隙直径，可以进入颗可以进入颗粒内部粒内部垂直向下移动，垂直向下移动，无规则无规则扩散进入凝胶扩散进入凝胶颗粒颗粒较慢较慢较长较长后从凝胶后从凝胶柱洗脱出柱洗脱出来来3电泳法电泳法(1)含含义：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。义：带电粒子在电场的作用下发生迁移
12、的过程。(2)原理：一些生物大分子具有可解离的基团，在一定原理：一些生物大分子具有可解离的基团，在一定pH下，下，会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。因各种分子带电性质的着与其所带电荷相反的电极移动。因各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，迁移速度不同，从差异以及分子本身的大小、形状不同，迁移速度不同，从而实现各种分子的分离。而实现各种分子的分离。(3)常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在测定蛋白质的相对分子质量时，通常使用测定
13、蛋白质的相对分子质量时，通常使用SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳，此方法也可用来分离蛋白质混合组分凝胶电泳，此方法也可用来分离蛋白质混合组分(亚基亚基)。1为什么相对分子质量较小的蛋白质经过色谱柱时的运动为什么相对分子质量较小的蛋白质经过色谱柱时的运动速度慢？速度慢？答案答案因因为相对分子质量较小的蛋白质要经过凝胶内部为相对分子质量较小的蛋白质要经过凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。的通道，路程较长，移动速度较慢。2缓冲液一般由哪些成分组成？缓冲液一般由哪些成分组成？答案答案由由弱酸和强碱弱酸盐组成，如弱酸和强碱弱酸盐组成，如H2CO3/NaHCO3和和NaH2PO4/Na2HPO4。
14、3决定电泳法中蛋白质运动方向和速率的因素有哪些？决定电泳法中蛋白质运动方向和速率的因素有哪些？答案答案所所带电荷的性质、分子大小及形状等。带电荷的性质、分子大小及形状等。1如图表示对某蛋白质溶液进行如图表示对某蛋白质溶液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果泳的结果(类似于纸层析法分离色素类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正，下列相关叙述不正确的是确的是()A蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子电的蛋白质分子(或多肽或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极会向着与其所带电荷相反的电极移动移动B蛋白质在蛋白质在S
15、DS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少决于其所带净电荷多少C蛋白质在蛋白质在SDS聚丙聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度烯酰胺凝胶中的迁移速度取决于其相对分子质量的取决于其相对分子质量的大小大小D电泳结果表明溶液中电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有两种，也的蛋白质可能有两种，也可能只有一种可能只有一种【问题导析问题导析】(1)蛋蛋白质分子或多肽所带电荷性质决定其运动的方向。白质分子或多肽所带电荷性质决定其运动的方向。(2)SDS与各种蛋白质形成与各种蛋白质形成 复合物。由于复合物。由于SDS所带所带电荷的量大大超过了蛋白质分子本身所带的电荷量，所以蛋电荷
16、的量大大超过了蛋白质分子本身所带的电荷量，所以蛋白质的迁移速度决定于蛋白质分子的白质的迁移速度决定于蛋白质分子的 。(3)图中分离开的两个分子可能是由一个蛋白质分解成的两条图中分离开的两个分子可能是由一个蛋白质分解成的两条 。蛋白质蛋白质SDS大小大小肽链肽链解析解析蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。在电场中发生迁移。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。
17、身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。SDS可使蛋白可使蛋白质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽有两种肽链链)，也可能是两种蛋白质。，也可能是两种蛋白质。答案答案B【一题多变一题多变】1图图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什么？么？答案答案负负电荷，因为它们移向了阴极一端。电荷，因为它们移向了阴极一端。2除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法还有哪种？还有哪种？答案答案琼琼脂糖凝胶电泳。脂糖凝胶电泳。二、血红蛋白的提取和
18、分离实验操作二、血红蛋白的提取和分离实验操作1样样品的处理品的处理(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤目的：去除杂蛋白。目的：去除杂蛋白。方法方法a采集血样采集血样b.低速短时间离心低速短时间离心c.吸取血浆吸取血浆d.盐水洗盐水洗涤涤e.低速离心低速离心重复重复d、e步骤三次。步骤三次。(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况(从上往下从上往下)：第：第1层：无色透
19、明的甲苯层；第层：无色透明的甲苯层；第2层：脂溶性物质的层：脂溶性物质的沉淀层沉淀层白色薄层固体；第白色薄层固体；第3层：血红蛋白的水溶液层：血红蛋白的水溶液红色透红色透明液体；第明液体；第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。层：其他杂质的暗红色沉淀物。将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。片刻后，分出下层的红色透明液体。目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。步对血红蛋白的纯化。(4)透析透析原理：透析袋能使小分子自由
20、进出，而将大分子保留在袋原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。内。过程：取过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有入盛有300 mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中的磷酸缓冲液中(pH为为7.0)，透析，透析12 h。目的：目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质；除去样品中相对分子质量较小的杂质；b用于更换样品的缓冲液。用于更换样品的缓冲液。2凝胶色谱操作凝胶色谱操作3纯度鉴定纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度断纯化的蛋
21、白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。4结果分析与评价结果分析与评价凝胶色凝胶色谱柱的谱柱的装填装填放一支与凝胶柱垂直的日光灯放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查凝胶直接检查凝胶是否装填得均匀是否装填得均匀加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖2 000或红或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整装填成功装填成功血红蛋血红蛋白的分白的分离离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出脱液缓
22、慢流出分离成功分离成功血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽分离分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关1为什么粗提取为什么粗提取DNA不能用哺乳动物的成熟红细胞，而分不能用哺乳动物的成熟红细胞，而分离血红蛋白能用？离血红蛋白能用？答案答案因因为哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和细胞为哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和细胞器，所以不含有器，所以不含有DNA，不能用于粗提取，不能用于粗提取DNA。哺乳动物。哺乳动物的成熟红细胞中充满了血红蛋白，所以可以用于分离血的成熟红细胞中充满了血红蛋白，所以可以用于分离血红蛋白。红蛋白。2从渗
23、透压对细胞的影响的角度分析，为什么洗涤红细胞从渗透压对细胞的影响的角度分析，为什么洗涤红细胞要用生理盐水，而释放血红蛋白要用蒸馏水？要用生理盐水，而释放血红蛋白要用蒸馏水？答案答案洗洗涤红细胞的目的是将细胞膜表面的杂蛋白去除，涤红细胞的目的是将细胞膜表面的杂蛋白去除，要保持红细胞不破裂，所以要使用等渗溶液要保持红细胞不破裂，所以要使用等渗溶液生理盐水。生理盐水。释放血红蛋白要使红细胞破裂，所以要置于低渗溶液释放血红蛋白要使红细胞破裂，所以要置于低渗溶液蒸馏水中，可以使红细胞吸水破裂。蒸馏水中，可以使红细胞吸水破裂。3血红蛋白释放以后，在凝胶色谱操作前，要进行哪两步血红蛋白释放以后，在凝胶色谱操
24、作前，要进行哪两步操作？其目的什么？操作？其目的什么？答案答案要要进行离心和透析，目的都是为了除去血红蛋白进行离心和透析，目的都是为了除去血红蛋白溶液中的一些杂质。溶液中的一些杂质。4如果红细胞洗涤不充分，则在离心分层时会出现怎样的如果红细胞洗涤不充分，则在离心分层时会出现怎样的异常现象？异常现象？答案答案如如果红细胞洗涤不充分，则离心分层后分层不明果红细胞洗涤不充分，则离心分层后分层不明显。显。2下图是用除去下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是验的装置，下列有关叙述不正确的是()A首先用图甲装置对滤液进行处理，其目
25、的是去除相对分首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质子质量较小的杂质B图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质子质量较小的蛋白质C用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集，连续收集D图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动带有一定量的电荷，在电场的作用下向
26、一极移动【问题导析问题导析】(1)甲甲图中的透析袋允许相对分子质量图中的透析袋允许相对分子质量 的物质通过。的物质通过。(2)图乙中的装置中，相对分子质量较小的蛋白质要经过凝胶，图乙中的装置中，相对分子质量较小的蛋白质要经过凝胶，所以经过的路程长，因此最晚从层析柱中洗脱出来。所以经过的路程长，因此最晚从层析柱中洗脱出来。(3)电泳法中决定蛋白质运动方向的是蛋白质的电泳法中决定蛋白质运动方向的是蛋白质的 。较小较小带电性质带电性质解析解析用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质质量较小的杂质。
27、图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。外面，在颗粒之间迅速通过。答案答案B【一题多变一题多变】1在在凝胶色谱操作前，获得的血红蛋白溶液中的杂质应尽凝胶色谱操作前，获得的血红蛋白溶液中的杂质应尽量少，哪些操作达到这一目的？量少，哪些操作达到这一目的？答案答案(1)用用生理盐水对红细胞进行洗涤，目的是洗去红生理盐水对红细胞进行洗涤，目的是洗去红细胞表面上的杂蛋白；细胞表面上的杂蛋白；(2)离心分层，目的是除去一些脂离心分层，目的是除去一些脂溶性物质；溶性物质；(3)透析，目的是除去一些小分子的杂质。透析，目的是除去一些小分子的杂质。2丙图中决定蛋白质运动方向和速度的因素有哪些？丙图中决定蛋白质运动方向和速度的因素有哪些？答案答案有有蛋白质所带电荷的性质、分子的大小和形态等。蛋白质所带电荷的性质、分子的大小和形态等。再见再见
