1、 基因基因,在希腊语中是在希腊语中是“给予生命给予生命”之意，之意，1909年，年，丹麦生物学家丹麦生物学家 W.Johannsen首先使用名词首先使用名词“基因基因”代替代替“遗传因子遗传因子”这个术语。随着遗传学、分子这个术语。随着遗传学、分子生物学、生物化学领域的发展，人们对基因本性的生物学、生物化学领域的发展，人们对基因本性的认识逐渐深入，基因的概念和涵义也不断地发展和认识逐渐深入，基因的概念和涵义也不断地发展和丰富。丰富。基基 因因 1926年，年，Morgan发表了发表了“基因论基因论”，指出基因，指出基因是在特定的染色体上，而且是呈直线排列在染色体是在特定的染色体上，而且是呈直线
2、排列在染色体上的遗传颗粒上的遗传颗粒，位于同源染色体的同一位置上的相位于同源染色体的同一位置上的相对基因叫做对基因叫做等位基因等位基因。基因是世代相传的，。基因是世代相传的，基因决基因决定遗传性状的表达定遗传性状的表达。1941年，年，Beade和和Tatum用用X射线照射射线照射链孢链孢霉菌使其产生不同的突变株霉菌使其产生不同的突变株，他们发现突变可，他们发现突变可致催化代谢的酶发生变化，因而提出了致催化代谢的酶发生变化，因而提出了“一个一个基因一个酶基因一个酶”的假说的假说。基因中的突变可导致它基因中的突变可导致它所负责的酶活性的改变所负责的酶活性的改变。直到直到1957年，科学家找到了证
3、明该假说的年，科学家找到了证明该假说的证据。证据。Ingram 通过实验证明，镰状细胞贫通过实验证明，镰状细胞贫血（血（sickle cell anemia）的病因是编码血红）的病因是编码血红蛋白的基因发生了突变，从而改变了血红蛋蛋白的基因发生了突变，从而改变了血红蛋白的氨基酸组成白的氨基酸组成。基因的生物学概念阐述了基因的功能基因的生物学概念阐述了基因的功能，如如基因是可遗传的、基因型决定表型、基因呈直基因是可遗传的、基因型决定表型、基因呈直线排列在染色体上、基因在世代相传的行为和线排列在染色体上、基因在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性等，功能表达上具有相对的独立性等，但尚未阐明但
4、尚未阐明基因究竟是什么？它的物质基础是什么？基因究竟是什么？它的物质基础是什么？随着科学的进步，今天已清楚地知道，随着科学的进步，今天已清楚地知道，基因基因（gene）是）是DNA分子中含有特定遗分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的基本单位。传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的基本单位。DNA是遗传的物质基础，是遗传的物质基础，基因位于染色体上基因位于染色体上,实际上是位于染色体的实际上是位于染色体的DNA上。上。基因是基因是DNA大分子的一个个片段，有复制、转录等主要的生物学功能，是生物大分子的一个个片段，有复制、转录等主要的生物学功能，是生物遗传繁殖的物质基础遗传繁殖的物质
5、基础。生物体的生物体的表型表型是通过产生许多特殊的是通过产生许多特殊的蛋白蛋白质质来实现的，而蛋白质由一系列的氨基酸组来实现的，而蛋白质由一系列的氨基酸组成，蛋白质的结构和活性由其氨基酸的排列成，蛋白质的结构和活性由其氨基酸的排列顺序来决定。而顺序来决定。而DNA的核苷酸序列能决定组的核苷酸序列能决定组成它所对应蛋白质的氨基酸序列。这种关系成它所对应蛋白质的氨基酸序列。这种关系叫做叫做遗传密码遗传密码。遗传密码是以三个核苷酸为一组翻译的，遗传密码是以三个核苷酸为一组翻译的，每个三核苷酸叫做一个密码子每个三核苷酸叫做一个密码子（codon），），编码一个氨基酸编码一个氨基酸。一个基因包括一系列从
6、。一个基因包括一系列从固定的起始位点读起并在固定的位点终止固定的起始位点读起并在固定的位点终止的密码子。的密码子。通常按通常按53方向书写方向书写，对应其，对应其蛋白质产物的蛋白质产物的N末端到末端到C末端。在任何确定末端。在任何确定的区域，的区域，DNA只有其中的一条链编码蛋白只有其中的一条链编码蛋白质质。随着分子生物学研究的进展，随着分子生物学研究的进展，基因不是用一段基因不是用一段DNA就可以概括的。就可以概括的。在原核生物中，常见几个结构基因组成一个操在原核生物中，常见几个结构基因组成一个操纵子，发生在结构基因区域的突变可把它们区别纵子，发生在结构基因区域的突变可把它们区别开来。但当突
7、变发生在操纵子的启动子区域或调开来。但当突变发生在操纵子的启动子区域或调控区，则操纵子所控制的所有结构基因都会受到控区，则操纵子所控制的所有结构基因都会受到影响。影响。在真核细胞中，首先转录出的核不均一在真核细胞中，首先转录出的核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）有不同）有不同的内含子剪接位点，可通过不同的剪接修饰，产的内含子剪接位点，可通过不同的剪接修饰，产生两种以上的不同的生两种以上的不同的mRNA，进而编码不同的蛋，进而编码不同的蛋白质。由于分子生物学技术的发展，如白质。由于分子生物学技术的发展，如DNA分子分子克隆、核苷酸序列测定、核酸分子杂
8、交等实验手克隆、核苷酸序列测定、核酸分子杂交等实验手段的不断出现，可从分子水平上研究基因的结构段的不断出现，可从分子水平上研究基因的结构和功能，丰富并深化了对基因本质的认识。和功能，丰富并深化了对基因本质的认识。还有一大类还有一大类RNA基因基因，如，如rRNA、tRNA、snRNA(small nuclear RNA)基因等，基因等，它们它们只转录生成只转录生成RNA，并不翻译蛋白质，并不翻译蛋白质，就无，就无法从遗传性状来分析它们了。因此，法从遗传性状来分析它们了。因此，现代现代分子生物学的基因概念应该是分子生物学的基因概念应该是：合成有功合成有功能的蛋白质或能的蛋白质或RNA所必需的全部
9、所必需的全部DNA序列序列（除部分病毒（除部分病毒RNA），即一个基因不仅包），即一个基因不仅包括编码蛋白质或括编码蛋白质或RNA的核苷酸序列，还包的核苷酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列。括为保证转录所必需的调控序列。从分子水平来说，基因有从分子水平来说，基因有三个基本特性。三个基本特性。基因可自体复制基因可自体复制 1953年年Watson-Crick 提出了提出了DNA双螺旋结构模型。说明了半双螺旋结构模型。说明了半保留复制机制，两股保留复制机制，两股DNA彼此分开，以彼此分开，以每一股为模板，按碱基配对的规则，各自每一股为模板，按碱基配对的规则，各自配上一股新的配上一股新的DNA
10、，复制便告完成。，复制便告完成。基 因 决 定 性 状基 因 决 定 性 状 生 物 体 的 表（现）型生 物 体 的 表（现）型（phenotype）是指有机体可见的或可计算的外在性）是指有机体可见的或可计算的外在性质，而质，而基因型基因型（genotype）是指控制这些表型的遗传是指控制这些表型的遗传因子因子。生物体的表型是通过产生许多特殊的蛋白质。生物体的表型是通过产生许多特殊的蛋白质来实现的，而来实现的，而DNA的核苷酸序列能决定组成它所对的核苷酸序列能决定组成它所对应蛋白质的氨基酸序列。应蛋白质的氨基酸序列。这种关系叫做遗传密码。这种关系叫做遗传密码。基因突变基因突变 基因通常是一个
11、基因通常是一个稳定的遗传单位稳定的遗传单位，但它也可能发生可但它也可能发生可遗传的变异遗传的变异，这种变异叫，这种变异叫基因突基因突变变（mutation）。突变以后的基因以新的形式稳定）。突变以后的基因以新的形式稳定遗传。遗传。携带突变基因的生物体叫突变体（携带突变基因的生物体叫突变体（mutant），），携带正常基因的生物体叫携带正常基因的生物体叫野生型野生型（wild type)。（1）原核生物）原核生物:一般只有一个染色体，即一般只有一个染色体，即核酸分子核酸分子，大多数为双螺旋结构，少数以单链，大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在。原核生物基因组较小，如大肠杆菌形式存在。原核生物基
12、因组较小，如大肠杆菌为为4.2106 bp，。因细菌生长迅速，生长条件，。因细菌生长迅速，生长条件易被人为控制，取材方便，故易被人为控制，取材方便，故原核生物是从分原核生物是从分子水平研究生物的遗传特性及信息传递的好素子水平研究生物的遗传特性及信息传递的好素材材。（2）真核生物真核生物 真核生物基因组比原核生物要复杂真核生物基因组比原核生物要复杂得多。其基本特点如下：得多。其基本特点如下：基因组中有大量低度、中基因组中有大量低度、中度、高度重复序列；基因大多数是不连续的，由编度、高度重复序列；基因大多数是不连续的，由编码的外显子与不编码的内含子镶嵌排列而成，非编码的外显子与不编码的内含子镶嵌排
13、列而成，非编码区多于编码区，约占码区多于编码区，约占90%以上的以上的DNA序列；基因序列；基因不存在操纵子结构不存在操纵子结构，功能相关的基因也大多分散在，功能相关的基因也大多分散在不同的染色体上，即使空间位置相近，也分别转录。不同的染色体上，即使空间位置相近，也分别转录。真核生物基因组真核生物基因组DNA大多与蛋白质结大多与蛋白质结合形成染色质，合形成染色质，染色质的基本结构单染色质的基本结构单位为核小体，其中位为核小体，其中DNA约占约占35%，RNA约占约占5%，其余约，其余约60%为组蛋白和为组蛋白和非组蛋白。非组蛋白。病毒病毒既不属原核生物，也不是真核生物，既不属原核生物，也不是真
14、核生物，它们是一种超分子的亚细胞生命形式，仅由它们是一种超分子的亚细胞生命形式，仅由核酸（核酸（DNA或或RNA）和蛋白质外壳组成，其）和蛋白质外壳组成，其繁殖要在寄生细胞内进行，其遗传机制与寄繁殖要在寄生细胞内进行，其遗传机制与寄主密切相关。主密切相关。基因根据其产物分为三类基因根据其产物分为三类 第一类第一类 蛋白质基因蛋白质基因 它的最终产物是它的最终产物是蛋白质蛋白质；第二类第二类 RNA基因基因 它的最终产物是它的最终产物是tRNA和和rRNA。第三类第三类 不转录的基因不转录的基因 它不产生任何产物，而对基因表达起调节控制作用。它不产生任何产物，而对基因表达起调节控制作用。基因根据
15、其功能可以分为两类基因根据其功能可以分为两类结构基因结构基因（structural gene）是指某些能决定某种多肽链（蛋白质）或酶是指某些能决定某种多肽链（蛋白质）或酶分子结构的基因。结构基因的突变可导致特定蛋白质（或酶）一级结构的改变分子结构的基因。结构基因的突变可导致特定蛋白质（或酶）一级结构的改变或影响蛋白质（或酶）量的改变。或影响蛋白质（或酶）量的改变。调控基因调控基因（regulator and control gene）是指某些可调节控制结构基是指某些可调节控制结构基因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能，或因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个结构
16、基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。人类基因包括人类基因包括4个区域个区域 编码区编码区，包括外显子与内含子，包括外显子与内含子前导区前导区，位于编码区上游，相当于，位于编码区上游，相当于mRNA 5末端非编码区（非翻译区）；末端非编码区（非翻译区）；尾部区尾部区，位于，位于mRNA 3编码区下游，相当编码区下游，相当于于3末端非编码区（非翻译区）；末端非编码区（非翻译区）；调控区调控区，包括启动子和增强子等。基因编，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼序列（码区的两侧也称为侧翼序列（flankingsequence）。）。1外
17、显子（外显子（exon）和内含子）和内含子（intron）大多数真大多数真核生物的基因为不连续基因（核生物的基因为不连续基因（interrupted或或discontinuous gene）或割裂基因（）或割裂基因（split gene）。所谓）。所谓割裂基因是指基因的编码序列在割裂基因是指基因的编码序列在DNA分子上是不连续分子上是不连续排列的，而是被不编码的序列所隔开。编码的序列称排列的，而是被不编码的序列所隔开。编码的序列称为外显子，对应于为外显子，对应于mRNA序列的区域，是一个基因表序列的区域，是一个基因表达为多肽链的部分。达为多肽链的部分。不编码的间隔序列称为内含子，内含子只转录，
18、不编码的间隔序列称为内含子，内含子只转录，在前在前mRNA（premRNA）时被剪切掉。）时被剪切掉。如果如果一个基因有一个基因有n个内含子，一般总是把基因的外显个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成子分隔成n+1部分。部分。外显子外显子内含子内含子外显子外显子内含子内含子外显子外显子外显子外显子内含子内含子真核生物中有的结构基因不含有内含子，真核生物中有的结构基因不含有内含子，如组蛋如组蛋白基因、干扰素基因等，它们大多数以基因簇的白基因、干扰素基因等，它们大多数以基因簇的形式出现，大多数的酵母结构基因也没有内含子。形式出现，大多数的酵母结构基因也没有内含子。2 外显子和内含子外显子和内含子接
19、头接头 每个外显子和内含子每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守的一致序列（接头区都有一段高度保守的一致序列（consensus sequence），即内含子），即内含子5末端大多数是末端大多数是GT开始，开始，3末端大多数是末端大多数是AG结束，称为结束，称为GT-AG法则法则，是普遍，是普遍存在于真核基因中。存在于真核基因中。3侧翼序列侧翼序列 在第一个外显子和最末一个外显子在第一个外显子和最末一个外显子的外侧是一段不被翻译的非编码区，称为侧翼序的外侧是一段不被翻译的非编码区，称为侧翼序列。侧翼序列中存在基因调控序列，对基因的活列。侧翼序列中存在基因调控序列，对基因的活性有重要影响。性有
20、重要影响。4启动子启动子 启动子（启动子（promoter）是基因中是基因中一段能结合一段能结合RNA聚合酶的聚合酶的DNA序列序列，由于，由于它与它与RNA聚合酶的结合，由此开始聚合酶的结合，由此开始转录转录。(1)TATA框框（TATA box）：其一致序列为）：其一致序列为TATATAA。它约在基因转录起始点上游约。它约在基因转录起始点上游约-3050bp处，基本上由处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基碱基对组成，是决定基因转录起始点的选择，为因转录起始点的选择，为RNA聚合酶的结合处之聚合酶的结合处之一，一，RNA聚合酶与聚合酶与TATA框结合才能开始转录。框结合才能开始转录。（2）
21、CAAT框框（CAAT box）：其一致序列为）：其一致序列为GGTCAATCT，是真核生物常有的调节区，位于，是真核生物常有的调节区，位于转录起始点上游转录起始点上游-80100bp处，可能也是处，可能也是RNA聚合聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。（3）GC框框（GC box）：有两个拷贝，位于）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录组成，是一个转录调控区，有激活转录调控的功能调控区，有激活转录调控的功能。5增强子增强子 增强子（增强子（enhancer）也是一段）也是一段DNA序列，序列，该序列能提高该
22、基因分子存在的某段该序列能提高该基因分子存在的某段DNA的转录活性的转录活性。在真核基因转录起始点的上游或下游一般都有增强子，在真核基因转录起始点的上游或下游一般都有增强子，增强子可与特异性细胞因子结合而促进转录的进行。增强子可与特异性细胞因子结合而促进转录的进行。研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同的细胞核有不同的特异性因子与增强子结合，从而对的细胞核有不同的特异性因子与增强子结合，从而对基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。6终止子终止子 在一个基因的末端往往有一段特在一个基因的末端往往有
23、一段特定顺序，它定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止具有转录终止的功能，这段终止信号的顺序信号的顺序称为终止子（称为终止子（terminator）。终）。终止子的共同顺序特征是在转录终止之前有一止子的共同顺序特征是在转录终止之前有一段回文顺序，约有段回文顺序，约有720核苷酸对。核苷酸对。在回文序列的下游有在回文序列的下游有68个个A-T对，因此，这段对，因此，这段终止子转录后形成的终止子转录后形成的RNA具有发夹结构，并具有具有发夹结构，并具有与与A互补的一串互补的一串U，因为，因为A-U之间氢键结合较弱，之间氢键结合较弱，因而因而RNA/DNA杂交部分易于拆开，这样的转录物杂交部分易于拆
24、开，这样的转录物从从DNA模板上释放出来是有利的，模板上释放出来是有利的，也可使也可使RNA聚聚合酶从合酶从DNA上解离下来，实现转录的终止上解离下来，实现转录的终止。基基 因因 克克 隆隆 基因克隆基因克隆 人类基因组人类基因组全序列的阐明将绘出一篇密码图全序列的阐明将绘出一篇密码图谱，随后需要了解的是：哪一段序列编码哪一谱，随后需要了解的是：哪一段序列编码哪一个基因？这一基因在体内功能是什么？一个生个基因？这一基因在体内功能是什么？一个生物学功能需要哪几个基因的协同作用？它们又物学功能需要哪几个基因的协同作用？它们又是如何协调控制着生命的正常活动的？以及哪是如何协调控制着生命的正常活动的？
25、以及哪些错误会导致各种病理现象的产生？。些错误会导致各种病理现象的产生？。基因克隆基因克隆 这一系列艰巨的、极富挑战性的解码工这一系列艰巨的、极富挑战性的解码工作促使我们进入了作促使我们进入了功能基因组功能基因组研究时代。研究时代。这中间最基础的工作是这中间最基础的工作是基因克隆基因克隆。基因克隆基因克隆1972年年,美国学者美国学者 Berg P等人首次在体外进等人首次在体外进行行 DNA的重组研究的重组研究,成功地构建成第一个成功地构建成第一个人工人工 DNA分子。分子。1973 年年,Cohen S等人将等人将带有四环素抗性表型的质粒带有四环素抗性表型的质粒 pSC101 和带有和带有新
26、霉素抗性的质粒新霉素抗性的质粒R6-3 分别用分别用 Eco RI 酶切酶切后后,在体外将两者连接起来在体外将两者连接起来,然后将连接产物然后将连接产物导入大肠杆菌导入大肠杆菌,成功地进行了无性繁殖成功地进行了无性繁殖,并得并得到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌,从而从而完成了完成了DNA体外重组和扩增体外重组和扩增,基因工程这门基因工程这门新兴学科也就应运而生。新兴学科也就应运而生。基因克隆基因克隆基因工程所采用的基本技术被称为基因工程所采用的基本技术被称为 DNA体外体外重组技术重组技术,也被称为基因克隆或分子克隆技术。也被称为基因克隆或分子克隆技术。基因
27、工程是指在体外条件下基因工程是指在体外条件下,人工将人工将DNA分子分子“剪切剪切“并重新并重新“拼接拼接”,形成一个新的杂合形成一个新的杂合DNA分子分子,然后然后将它导入微生物或真核细胞内将它导入微生物或真核细胞内,使该分子得到无限繁使该分子得到无限繁殖殖,并可使该基因在细胞中表达并可使该基因在细胞中表达,产生出人类所需要的产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。基因产物或改造、创造新的生物类型。基因克隆基因克隆一、一、克隆概念克隆概念：克隆（原指一个亲本细胞产生成千：克隆（原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成群体的过程上万个相同细胞组成群体的过程,clone），也就是）
28、，也就是细胞的无性繁殖。细胞的无性繁殖。二、分子克隆的关键技术：二、分子克隆的关键技术：DNA重组技术。该技术重组技术。该技术是基因工程技术的核心。基本操作步骤如图是基因工程技术的核心。基本操作步骤如图1所示所示。目的基因目的基因克隆载体克隆载体连连 接接DNA重组体形成重组体形成含重组子的克隆菌含重组子的克隆菌表达产物表达产物RE消化消化RE消化消化T4 DNA连接酶连接酶转化（转染）宿主细胞转化（转染）宿主细胞诱导表达诱导表达1、获得某一基因或、获得某一基因或DNA片段，将其片段，将其插入载体插入载体DNA分子中，形成一个新分子中，形成一个新的重组的重组DNA分子。分子。2、将、将DNA重
29、组体导入受体细胞（宿重组体导入受体细胞（宿主细胞），并在其中复制保存。主细胞），并在其中复制保存。3、阳性重组体细胞的筛选和鉴定。、阳性重组体细胞的筛选和鉴定。T-vector or T-easy vectorExpression vector 外源基因经酶外源基因经酶切插入特定的切插入特定的表达载体表达载体用通用引物测定基因核苷酸序列用通用引物测定基因核苷酸序列在原核或真核细胞中表达在原核或真核细胞中表达SDS-PAGE表达水平测定表达水平测定纯化产物纯化产物Western blot免疫反应性鉴定免疫反应性鉴定免疫原性鉴定免疫原性鉴定分子筛分子筛反相层析反相层析亲和层析亲和层析功能性鉴定功能
30、性鉴定活性鉴定活性鉴定外源基外源基因因PCR product 基因克隆基因克隆三、三、基因克隆所需的生物材料基因克隆所需的生物材料1、RNA（mRNA）、）、DNA抽提试剂盒抽提试剂盒2、cDNA合成试剂盒合成试剂盒3、工具酶：、工具酶：（1）限制性内切酶）限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是一类能识别和切割）是一类能识别和切割双链双链DNA分子内特定碱基序列的核酸内切酶，也是原核细胞所特有的酶。分子内特定碱基序列的核酸内切酶，也是原核细胞所特有的酶。只有只有II型内切酶型内切酶在分子生物学中应用。在分子生物学中应用。各型限制性核酸内切酶特征各型限制性核酸
31、内切酶特征切割位点切割位点甲基化作用甲基化作用限制作用是否需要限制作用是否需要ATPI 型型非特定在识别序列前后非特定在识别序列前后100-1000 bP范围内范围内有有需要需要II 型型特定特定在识别序列中或近处在识别序列中或近处无无不需不需III-型型特定特定在识别序列在识别序列3端端25-27bp处处有有需要需要影响影响限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶酶解反应的因素酶解反应的因素1.DNA纯度纯度,DNA纯度高纯度高,酶解效率也高。酶解效率也高。2.DNA分子的结构和构型分子的结构和构型,环状超螺旋环状超螺旋DNA的酶解效的酶解效率低率低 于线型于线型DNA,限制酶识别序列中核苷酸的甲基化将阻限制酶识别序列中核苷酸的甲基化将阻止限制酶的切割止限制酶的切割;3.反应体系反应体系,包括缓冲糸统、包括缓冲糸统、pH值、值、Mg离子浓度、离子浓度、NaCl浓度等浓度等.4.温度和时间温度和时间,一般为一般为370C;在保证限制酶切割效率前在保证限制酶切割效率前提下提下,尽量避免长时间酶解反应尽量避免长时间酶解反应,5.酶及酶量酶及酶量,高质量的酶及不使用过高的酶浓度高质量的酶及不使用过高的酶浓度,防止防止杂酶活性的产生。杂酶活性的产生。
