1、TextTextText讲授内容n显微镜的使用n细菌的形态学检查方法n细菌的基本形态和特殊结构观察显微镜显微镜n普通光学显微镜（light microscope）n暗视野显微镜（dark-field microscope）n相差显微镜（phase contrast microscope）n普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌均能清楚看到。n暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。n相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。普通光学显微镜暗视野显微镜 倒置相差显微镜显微镜油镜的使用(一)n低倍镜对光，将光线调至最强程度(聚光器提高，光圈全部开放)。n转动
2、粗调节器使镜筒上升，滴香柏油1小滴(不要过多，不要涂开)于接物镜正下方标本上。n转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。n俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗调节器使油镜头徐徐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。显微镜油镜的使用(二)n慢慢转动粗调节器，使油镜头徐徐上升至见到标本的物象为止。n转动微调节器，使视野物象达到最清晰的程度。n左手徐徐移动推进器，并转动微调节器以观察标本。n标本观察完毕后，转动粗调节器将镜筒升起，取下标本玻片。立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。显微镜的保护(一)n显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出。不要只用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻
3、轻放在实习台上或装入木箱内。n显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。显微镜的保护(二)n显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。n显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成“八”字形，转动粗调节器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰。细菌形态学检查方法细菌形态学检查方法n不染色检查法不染色检查法n染色检查法染色检查法n负染色法负染色法（一）不染色标本检查n应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式。n常用方法：压滴法、悬滴法、暗
4、视野映光法。1、压滴法载玻片载玻片细菌悬液细菌悬液盖玻片盖玻片2、悬滴法镜检镜检盖玻片盖玻片细菌悬液细菌悬液凹玻片凹玻片染色检查法 n细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。染色检查法n常用染料常用染料n染料分天然染料和人工染料。n依据助色基解离后的带电情况，要将染料分为碱性和酸性两种。碱性染料常以氯化物的形式存在，电离后带正电荷。如美兰、结晶紫、碱性复红等。酸性染料电离后带负电荷。如伊红、刚果红等。染色检查法n染色的一般原理和程序染色的一般原理和程序细胞壁通性学说：与肽聚糖结构有关。化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。等电点学说：与细
5、菌所带电荷有关。染色检查法n染色的一般原理和程序染色的一般原理和程序n染色材料准备涂片制备染色。n染色材料准备要注意染液配制、玻片处理、标本采集等几个环节。n涂片制备是在玻片上制备菌膜的过程。通常是用接种环将细菌涂成1cm2cm大小菌膜，待自然干燥后经固定处理再行染色。n染色是增加被染物折光性过程。根据形态学检查要求可将染色法分为单染色法和复染色法。涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗、吸干水洗、吸干镜检镜检制备涂片标本制备涂片标本染色染色固定n固定的目的在于：杀死细菌。使细胞物质凝固和增加细菌通透性。使菌膜较牢固地固定于玻片上，避免其在染色过程中脱落。n固定可采用加热法、冻干法、和化学法。碱
6、性美蓝液和石炭酸复红液单染色法碱性美蓝液和石炭酸复红液单染色法【染液】碱性美蓝液、石炭酸复红液【方法】将上述某种当液覆盖于菌膜上，常温染1min3min，水洗，待干或吸水纸印干，镜检。【结果】菌体呈蓝色或红色。单染色法常用复染色方法 n革兰氏染色法 n抗酸染色法 n异染颗粒染色法n荚膜染色法 n芽孢染色法 n鞭毛染色法 n染色涂片保存法 革兰染色（Gram stain）n最经典、最常用的染色方法。n通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类。革兰染色结果n紫色革兰阳性菌n红色革兰阴性菌革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阴性菌革兰阴性菌影响革兰染色的因素n操作因素n涂片的厚薄；脱色时间的长短。n染液因
7、素n卢戈碘液放置时间过长；95乙醇挥发；结晶紫与草酸铵混合时间太长。n细菌因素n细菌种类；细菌菌龄等。抗酸染色法n抗酸染色法是用于区分混合标本中分枝杆菌属细菌（如结核杆菌、麻风杆菌）的鉴别染色方法。【原理】完整分枝杆菌中含有分枝菌酸，能在加热条件下与渗入细胞内石炭酸复红牢固结合，其细胞壁有阻止染料脱出作用。因此能抵抗盐酸酒精脱色使菌体染成红色，称抗酸性细菌。非抗酸性细菌不含分枝菌酸，不能抵抗盐酸酒精脱色，菌体被美蓝复染成蓝色。【染液】初染液即石炭酸复红原液。脱色液、复染液即碱性美蓝液。抗酸染色法【方法】将结核病人痰、麻风病人鼻分泌物或麻风病人皮肤刮取物，按涂片干燥固定过程制备涂片。【结果】分枝
8、杆菌呈红色杂菌和背景物呈蓝色。异染颗粒染色法n细菌异染颗粒是某些细菌（白喉杆菌、鼠疫杆菌、结核杆菌等）常见的胞质颗粒。奈瑟（Neisser）法是常用染色方法。【原理】【染液】甲液：将美兰0.1g溶于2ml无水乙醇，加5%冰醋酸5ml，再加蒸馏水至100ml，过滤备用。乙液：将俾斯麦褐1g溶于10ml无水乙醇，加蒸馏水至100ml，过滤备用。【方法】常规制片后滴加甲液染1min，水洗。滴加乙液染1/2min，水洗，待干，镜检。异染颗粒染色法【结果】菌体呈黄褐色，异染颗粒呈深蓝色。【注意事项】由于异染颗粒是储存营养物质场所，因此就人工培养菌而言，应注意培养基成分和培养时间。一般认为营养充分，颗粒多
9、而大。营养缺乏，颗粒少而小，甚至消失。如白喉杆菌的培养，在培养基内加入适量葡萄糖、血清及甘油有利于异染颗粒形成。荚膜染色法n荚膜是某些细菌分泌于胞壁外的一层较厚的粘稠性物质。用普通培养基传代细菌荚膜易丢失。荚膜染色可采用动物组织或组织液涂片。黑斯（Hiss）染色是常用的染色方法。【原理】【染液】甲液：将结晶紫或碱性复红酒精饱和液5ml与95ml蒸馏水混合。乙液：20%硫酸铜水溶液。【方法】在自然干燥涂片上滴加甲液，微火加温染1min，不水洗，直接滴加乙液冲去甲液，待干，镜检。荚膜染色法【结果】菌体和背景物呈蓝紫色或红色，荚膜呈淡蓝紫色或淡红色。【注意事项】不能加热干燥或固定涂片，并避免水冲洗玻
10、片，防止荚膜皱缩或脱失。芽孢染色法n芽孢染色可利用芽孢折光性强、不易着色特点，采用常温单染色法，用菌体颜色衬托亮圆芽孢。【染液】初染液：5%孔雀绿水溶液。复染液：0.5%沙黄水溶液。【方法】初染：加水2滴3滴于小试管（0.75cm10cm）中，用接种环从培养基斜面上挑取较多菌苔于试管中，充分打匀，使成较浓稠菌液。加入初染液0.3ml0.4ml。将此管于沸水加热15min20min。制备涂片：从试管中挑取菌液于洁净玻片上，并涂成薄膜，待干后，通过火焰3次进行固定。脱色：用水洗，使菌体脱色。复染：加复染液染色1min，水洗，待干后镜检。芽孢染色法【结果】芽孢呈绿色，菌体呈红色。【注意事项】菌液中应
11、含较多芽孢菌以保证涂片质量。也可采用先取菌制备涂片，再进行初染脱色复染过程。但由于初染过程是用火焰直接加热玻片，应掌握好加热温度和加热时间。鞭毛染色法n鞭毛是细菌的运动器官。由于其直径只有10nm20nm，一般染色不能看到，故须先用媒染剂增粗鞭毛，再经复染使其着色。【原理】【方法】涂片制备 染色：涂片通过火焰稍加热，并趁热用甲液覆盖菌膜。将玻片离开火焰轻轻倾动，见甲液由半透明变为不透明浓备状（约4min以上）用稀酸液冲去甲液，水洗。加乙液后微微加热玻片，见菌膜变黄（约3s左右），用稀酸冲去乙液，水洗。加丙液后立即用热蒸馏水或自来水漂洗，然后常温水洗，待干，镜检。鞭毛染色法【结果】菌体呈深红色，
12、鞭毛呈浅红色。【注意事项】因甲液中双氧水和三氯化铁在空气中时间过长作用会降低，染色时，应随时少量添加二者。甲液媒时间短作用达不到，时间长鞭毛可能过粗，操作可在媒染时间上加以调整。负染色检查法n负染色法可观察相对自然状态下的细菌细胞形态。【原理】染料与活体标本接触时，由于染料带负电荷与活体标本表面所带电荷性相似，故不具亲和力，不能将菌体着色（死菌可被某些酸性染料如刚果红着色）。而已着色的背景在显微镜下可衬托出透亮无色的菌体和荚膜的形态。【方法】墨汁法苯胺黑-碱性复红法刚果红法【应用】用于观察活体标本。如墨汁法观察新型隐球菌，高倍镜下可见圆形，厚壁，围绕菌体的荚膜芽生现象。用于大致区别死菌和活菌数
13、量。如刚果红法。负染色检查法负染色检查法【注意事项】菌液浓度与染液比例要适当。如真菌菌液浓度应低，细菌菌液浓度应高。采用墨汁法要避免将高度电解物质（如酸类）与其接触，因它能使墨汁中胶体絮集，产生堆积沉淀现象，影响观察效果。用载玻片与盖玻片之间存有液体的湿片观察标本时，应防止液体外溢，必要时用蜡或凡士林封严四周。细菌的基本形态和特殊结构观察细菌基本形态球菌细菌基本形态杆菌细菌基本形态弧菌细菌特殊结构芽胞细菌特殊结构荚膜细菌特殊结构鞭毛食品和药品中常见的细菌食品和药品中常见的细菌肠杆菌科n肠炎沙门氏菌肠炎沙门氏菌n伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus
14、aureus链球菌属链球菌属n酿脓链球菌酿脓链球菌Streptococcus pyogenesn肺炎链球菌肺炎链球菌S.pneumoniaen肉毒梭菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)n破伤风梭菌破伤风梭菌(C.tetani)芽孢杆菌属芽孢杆菌属n炭疽芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)n蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌(B.cereus)n炭疽芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)n蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌(B.cereus)假单胞菌属
15、假单胞菌属霍乱弧菌霍乱弧菌vibrio cholerae幽门螺杆菌幽门螺杆菌乳杆菌属乳杆菌属n嗜酸乳杆菌(Lactococcus acidophilus)n乳乳杆菌(L.lactis)n保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)嗜盐杆菌属嗜盐杆菌属(Halobacterium salinarium)嗜盐球菌属嗜盐球菌属(H.morrhuae)食品和药品中常见的真菌食品和药品中常见的真菌n曲霉属曲霉属n青霉属青霉属n镰刀菌属镰刀菌属n毛霉毛霉n根霉根霉n木霉木霉n交链孢属交链孢属n单端孢霉属单端孢霉属n头孢霉属头孢霉属n酵母酵母n急性病毒性胃肠炎由轮状、诺沃克、类诺沃克、萼状、星状病毒引起。n病
16、毒性胃肠炎占美国发生的全部传染性腹泻的30%-40%，超过细菌和寄生虫性腹泄。常攻击1-11月的婴儿。n乙肝、甲肝、戊肝、脊髓灰质炎、朊病毒、慢病毒都可由水、食物传播。食品和药品中常见的病毒食品和药品中常见的病毒诺沃克病毒 乙肝病毒轮状病毒星状病毒4 4 食品中常见的寄生虫食品中常见的寄生虫n蛔虫蛔虫n绦虫绦虫n囊虫囊虫n肝吸虫（华枝睾吸虫）：最严重的食源性寄生肝吸虫（华枝睾吸虫）：最严重的食源性寄生虫虫n旋毛虫旋毛虫n姜片虫姜片虫n上述各种寄生虫的虫卵上述各种寄生虫的虫卵食品中常见的寄生食品中常见的寄生虫虫5 螨螨尘尘螨螨疥疥螨螨皮脂蠕螨皮脂蠕螨体体螨螨细菌培养n细菌培养的目的是获取纯种、进
17、行鉴定与研究以及菌种的保存与传代等。n运用无菌操作技术，提供适当的营养基质（培养基），以及适宜的培养方法和条件是达到上述目的的关键。无菌技术无菌技术 n 操作要点1无菌室在使用前，用紫外灯照射30min60min进行空气消毒。2在进行接种、倾注琼脂平板时均须在无菌室、超净工作台或接种罩内操作。3用接种环分离和移种细菌时，使用前后均需采用火焰灭菌。4凡打开或关闭无菌试管和烧瓶时，管口通过火焰2次3次，以杀灭可能吸附于管口或瓶口的细菌。开启后的试管和烧烧应尽量靠近火焰，且瓶口部切忌向上和长时间暴露于空气中。操作时，不可造成含菌材料污染台面和其它物体。无菌技术无菌技术 n 操作要点操作要点5所用的物
18、品均应进行严格的消毒，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触。6对病人采血或作穿刺、接种等，局部必须进行消毒；自动物体内抽血或移种时，应先剪去局部毛后，再进行常规消毒。7工作完毕，室内空气用紫外灯照射30min、实验人员认真消毒洗手。8因为慎造成污染时，应及时用消毒液处理。细菌培养n培养基的制备n细菌的接种和培养n细菌的生长现象n菌种的保存及保管培养基的制备培养基的制备 n培养基（culture medium）是指人工配制的供细菌生长繁殖的营养基质，是用人工的方法将多种营养物质按照各种细菌的需要而组合成的混合营养料。n主要用途：繁殖及分离纯种细菌；传代和保存；鉴别细菌的种属；研究细菌的生理及生化
19、特性；制造菌苗、疫苗或其它微生物制剂。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；常规高压蒸汽灭菌：常规高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm2,121.315-30分钟；分钟；0.56kg/cm2,112.615-30分钟分钟培养基的制备培养基的制备n培养基营养物质 蛋白胨（peptone）
20、、肉浸液、牛肉浸膏（beef extract）、酵母浸膏（yeast extract）、糖类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类。n水分n凝固物质 琼脂（agar）、明胶、蛋白、血清等 n抑制剂和指示剂 抑制剂和指标剂不是细菌生长繁殖所需物质，而是用于选择、鉴定细菌和结果判断。培养基的种类培养基的种类（一）按用途的分类（一）按用途的分类n 基础培养基（basal medium）n营养培养基（nutrient medium）n增菌培养基（enrichment medium）n选择性培养基（selective medium）n鉴别培养基（differential medium）n厌氧培养基（
21、anaerobic medium）（二）按物理性状分类（二）按物理性状分类n液体培养基（liquid medium）n半固体培养基（semisolid medium）n固体培养基（solid medium）（三）按成分分类（三）按成分分类n合成培养基（synthetic medium）n天然培养基（undefined medium）按用途不同分类按用途不同分类基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基需的基本营养物质的培养基用来将某种或某类微生物从混杂的用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基微生物群体中分
22、离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基选择培养基在基础培养基中加入某些特殊营养在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基物质制成的一类营养丰富的培养基微生物产生某种代谢产物，与培养微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化学反应，产生明显的特征变化牛肉膏蛋白胨培养基是最常牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基用的基础培养基营养培养基营养培养基特殊营养物质包括血液、血清、酵特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等母浸膏、动植物组织液等在培养基中加入
23、相应的特殊营养物质在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长生长，有利于所需微生物的生长按物理状态不同分类按物理状态不同分类solid medium固体培养基固体培养基liquid medium液体液体培养基培养基在液体培养基中加入一定量凝固在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为量一般为1.5%-2.0%1.5%-2.0%琼脂含量一般为琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何不加任何凝固剂凝固剂semisolid medium半固体半固体培养基培养基固体培养基
24、常用来进行微生物的分固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏离、鉴定、活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征、分类鉴观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定定及噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的微生物的基础理论和应用方面的研究研究 各种培养基各种培养基固体基斜面半固体临床常用的培养基n基础培养基：肉汤，普通琼脂平板n营养培养基：血液琼脂培养基，巧克力血培养基n选择培养基：SS琼脂培养基n鉴别培养基：EMB琼脂培养基n特殊培养基：厌氧培养基培养基制备的一般程序培养基制备的一般程序 n培养基种类虽多，但其制
25、备的基本程序是相似的，即调配、溶化、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、检定七个步骤。n保存：培养基的贮存主要是防止干涸、变质和污染三个方面。二、细菌的分离培养技术 n大多数细菌都可用人工的方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究各种生物学特性。培养细菌时，根据研究的目的和细菌生长的需要，要采用不同的接种技术和培养方法。n接种技术一般分为分离培养法和纯种细菌接种法（一）接种工具（一）接种工具n接种工具有接种环、接种针、玻璃涂布棒 接种针接种针用于穿刺接种细菌，接种环接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。L L型玻璃棒：型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。（二）接种环境（二）接种环境接种罩、
26、生物安全柜或无菌室内进行.三级生物安全柜三级生物安全柜（三）细菌接种的基本程序（三）细菌接种的基本程序杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本灭菌接种环灭菌接种环接种接种细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序取菌种试管和待取菌种试管和待接种的斜面试管接种的斜面试管灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种接种后灭菌接种环接种后灭菌接种环（四）细菌的接种方法（四）细菌的接种方法n平板划线接种法 n斜面接种法 n半固体培养基接种法 n液体培养基接种法 平板划线接种法目
27、的：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。n方法：方法：n曲线划线法曲线划线法n分区划线法分区划线法n倾注平板法倾注平板法n平板涂布接种法平板涂布接种法平板划线接种法平板划线接种法1曲线划线接种法n多用于含菌量不多的标本或培养咽拭、棉拭所取的培养物。n方法：方法：用接种环蘸取标本少许，或咽拭、棉拭培养物直接轻轻涂布于平板上1/5处，然后左右来回以曲线形式作连续划线接种，注意线与线之间既要留有适当的距离，又要尽可能地利用效面积。平板划线接种法平板划线接种法2分区划线接种法 适用于含菌量较多的标本。第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接
28、种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环1234接种方法接种方法培养结果培养结果132注意事项：注意事项：1.区和区之间要灭菌区和区之间要灭菌2.区不要接上区区不要接上区3.用力适当，不要划破琼脂表面用力适当，不要划破琼脂表面4.注意无菌操作注意无菌操作1.区和区之间要灭菌区和区之间要灭菌2.区不要接上区区不要接上区3.用力适当，不要划破琼脂表面用力适当，不要划破琼脂表面4.注意无菌操作注意无菌操作平板划线接种法平板划线接种法3倾注平板法 用于细菌计数。被检材料内若含有两种或两种以上的细菌时，可借溶化的琼脂将细菌冲散；待琼脂冷凝后，已分散的细菌被固定而在原地形成菌落。平板划线接种法平板划线
29、接种法4.平板涂布接种法：n用于测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种。斜面接种法斜面接种法1划线接种法 2穿刺划线接种法 琼脂斜面培养基接种法琼脂斜面培养基接种法 主要用于纯培养和保存菌种，或细菌的某些鉴别试验。主要用于纯培养和保存菌种，或细菌的某些鉴别试验。斜面接种法斜面接种法1划线接种法 2穿刺划线接种法 琼脂斜面培养基接种法琼脂斜面培养基接种法 主要用于纯培养和保存菌种，或细菌的某些鉴别试验。主要用于纯培养和保存菌种，或细菌的某些鉴别试验。半固体培养基接种法半固体培养基接种法半固体培养基穿刺接种法半固体培养基穿刺接种法 n穿刺接种法，用于保存菌种或观察细菌动力。液体培养基接种法液体培养基接
30、种法液体培养基接种法液体培养基接种法n可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验。（五）细菌的培养方法（五）细菌的培养方法n将上述已接种细菌的培养基置37恒温培养箱中孵育1824h，观察细菌的生长现象。n根据细菌对氧气的需求不同，可将细菌培养分为需氧培养法、二氧化碳培养法、需氧培养法、二氧化碳培养法、厌氧培氧法厌氧培氧法。细菌培养方法n需氧培养法（一般培养）n适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。n培养温度：37（采用恒温培养箱）。n培养时间：1824h。n二氧化碳培养法n适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。n可采用烛缸法、二氧化碳培养箱、化学法。厌氧培养法n厌氧培养法：厌氧菌的培养基分为二类
31、，即液体培养基和固体培养基。液体培养基 n在培养时应进行如下工作：（1）煮沸培养基10min15min，急速冷却，立即接种。（2）在培养基中加入0.05%0.1%的琼脂，使对流现象减少到最低限度。不适宜于绝对厌氧菌的培养。（3）厌氧菌初代培养，需培养48h后才能初步观察。若标本直接镜检为阳性，而48h培养后不见生长，可从液体培养基中再转种平板现象。疱肉培养基（cooked meat medium）n肉渣中含有谷胱甘肽及不饱和脂肪酸，前者可发生氧化还原发应，降低环境中的氧化势能，后者经肌肉中正铁血红素触酶作用后，能吸收水环境中的氧气，加之液面用凡士林封闭，造成缺氧状态。n接种时，先将培养基表面凡
32、士林融化，斜持试管片刻，使凡士林粘附于管壁一侧，种入标本，使与肉渣充分混合，再加热溶化凡士林，使之覆盖在培养基表面，置孵箱中培养。固体培养基n厌氧罐培养法 n厌氧气袋法 n培养箱法 抽气换气法 气体发生袋法（Gas-Pak法）厌氧培养箱厌氧培养箱厌氧产气袋厌氧产气袋厌氧罐厌氧罐三、细菌在培养基上的生长现象三、细菌在培养基上的生长现象固体培养基上细菌的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象 细菌在半固体培养基中的生长现象1、细菌在固体固体培养基中的生长现象n菌落（colony）n定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。n纯培养（pure culture）：从固体培养基上
33、挑一个菌落，移种到另一个培养基中，生长出来的细菌即为纯种，也称为纯培养。n菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。n菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落与菌苔菌落菌落菌苔菌苔细菌菌落的特征细菌菌落的特征一般都较小，菌落与培养基结合不紧密，用接种针容易挑起，多数表面较光滑、湿润、较粘稠，易挑取，质地均匀，色泽多样。单菌落（单菌落（clone)菌落（菌落（R型）型）菌苔菌苔(lawn)细菌的群体形态细菌的群体形态细菌菌落特征：常见的平面正面图细菌菌落特征：剖面图菌落的三个类型1.光滑型菌落（Smooth type Colony）又称S型2.粗糙型菌落（Ro
34、ugh type Colony）又称R型3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型菌落（S型）culture plate菌落(R型)影响菌落形态的因素各种微生物在一定条件下形成的菌落，其形态特征有一定的稳定性和专一性，因而可以作为识别、鉴定菌种的一个依据，但也受某些因素的影响，观察时应加以注意。1 1、邻近菌落、邻近菌落2 2、培养时间、培养时间3 3、培养基成分、培养基成分4 4、培养温度、培养温度杂菌污染杂菌污染巧巧克克力力平平板板菌落生长示意图菌苔(lawn)鉴别及选择培养基nEMB琼脂平板上大肠菌菌落具有金属光泽nSS琼脂平板上大肠菌为粉红菌落2、细菌在液体液体培养
35、基中的生长现象生长特性包括：n发育程度：发育程度：以有无生长，微弱、中等、旺盛来表示。n浑浊度：浑浊度：有无浑浊以及浑浊的程度（以混、中等、微混、透明表示）；均匀浑浊、有颗粒；絮状生长。n液体表面性状：液体表面性状：有无表面生长及生长的性状，如膜状（厚薄）、环状、皱状或呈颗粒状。n其它：其它：有无色素，有无气味，有无产酸情况，有无气体产生。细菌在液体液体培养基中的生长现象沉淀生长沉淀生长浑浊生长浑浊生长表面生长表面生长 细菌在液体液体培养基中的生长现象菌膜菌膜菌沉淀菌沉淀均匀浑浊均匀浑浊对照对照3、细菌在半固体半固体培养基中的生长现象n有鞭毛细菌：n在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘
36、模糊。n无鞭毛细菌：n只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力有动力 现象现象无动力无动力 现象现象四、菌种的保存和保管四、菌种的保存和保管菌种的保存菌种的保管（一）菌种的保存n必须注意以下问题：（1）控制传代次数（2）用典型菌落传代（3）通过易感动物恢复固有特性 菌种保存方法：n固体培养基保存法 n半固体穿刺保存法 n干燥保存法 n液氮超低温保存 固体培养基保存法 n普通琼脂斜面保存法 适合于营养要求不高细菌的保存。n血琼脂斜面保存法 适合于对营养要求高细菌的保存。n鸡蛋斜面保存法 适合保存Vi抗原的沙门氏菌属细菌及含表面抗原的细菌 半固体穿刺保存法n适合于肠道杆
37、菌及葡萄球菌等一般细菌的保存。n当细菌生长良好后，在其表面加一层无菌的液体石蜡，以全部浸泡后高出1cm为宜，在4冰箱中，一般细菌可保存数月。n凡需特殊培养的细菌，则分别选用各自适宜的培养基进行保存。干燥保存法n干燥保存法是将细菌体内的水分蒸发掉，使细菌处于代谢停滞的状态，从而达到长期保存的目的。n干燥保存法有多种，如砂土干燥保存法，明胶保存等，其中最好的方法是冷冻真空干燥保存法。干燥保存法准备安瓿管制备脱脂牛奶 制备菌液 分装菌液 预冻 真空干燥 封管 复苏培养 液氮超低温保存n 将菌种保存在-150196超低温的液氮中。n材料：菌种、培养基、设备、试剂。n方法和步骤：准备安瓿管 制备保护剂
38、制备细菌悬液 加保护剂 分装菌液 冻结 保存 复苏培养 （二）菌种的保管n一般细菌大多保存在4冰箱中，但霍乱弧菌、绿脓假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存，而脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈氏菌及初次分离的流感嗜血杆菌需保存于37孵箱中。n保管的菌种应做好鉴定记录，设专人负责，建立菌种登记本。n非干燥菌种注意定期传代或必要的重复鉴定，以防菌种变异。细菌常见的生化反应细菌常见的生化反应n糖类代谢试验糖类代谢试验n蛋白质代谢试验蛋白质代谢试验 n碳源和氮源利用试验碳源和氮源利用试验 n呼吸酶类试验呼吸酶类试验 n其它酶类试验其它酶类试验 1.糖类发酵试验2.氧化-发酵试验（OF试验）3.甲基红（methyl r
39、ed,MR）试验4.V-P（Voges-Proskauer）试验 5.-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）1.吲哚（indole）试验2.（又称靛基质试验）3.2氨基酸脱羧酶试验4.3精氨酸双水解酶试验5.4苯丙氨酸脱氨酶试验6.5硫化氢试验7.6明胶液化试验8.7尿素酶试验1.柠檬酸盐利用试验2.2丙二酸盐利用试验3.3醋酸盐利用试验4.4马尿酸钠水解试验1.氧化酶试验2.2过氧化氢酶（触酶）试验3.3硝酸盐还原试验1.1.卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验2.2.2 2DNADNA酶试验酶试验3.3.3 3凝固酶试验凝固酶试验糖发酵试验n原理 多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产酸产气)pH 指示剂呈酸性变色(
40、若产气者有气泡出现)n培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管n试剂：酚红、溴甲酚紫等n结果:培养基呈酸性变色n应用：观察细菌对糖度的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定糖类代谢实验糖类代谢实验糖发酵试验结果判断糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色变色、有气泡分解糖产酸、产气酸性变色变色、无气泡分解糖产酸、不产气培养基不变色不分解糖糖发酵试验甲基红试验n原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。n培养基：葡萄糖蛋白胨水n试剂：甲基红试剂n结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：n应用：是
41、肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌糖类代谢实验糖类代谢实验葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基红试剂甲基红试剂培养基培养基变红变红甲基红试验甲基红试验甲基红试验（V-P试验）n原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。n培养基：葡萄糖蛋白胨水n结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：n应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌糖类代谢实验糖类代谢实验葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基
42、甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰V-P试剂试剂培养基培养基变红变红VP试验试验脱酸脱酸葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基红试剂甲基红试剂培养基培养基变红变红乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰V-P试剂试剂培养基培养基变红变红脱酸脱酸蛋白质类代谢试验n靛基质试验n硫化氢试验n苯丙氨酸脱氨试验n尿素酶试验蛋白质代谢实验蛋白质代谢实验靛基质试验n原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。n培养基：蛋白胨水n试剂：靛
43、基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）n结果：加入试剂后，培养基出现红色红色液面：+培养基液面为黄色：n应用：用于肠道杆菌的鉴定蛋白质代谢实验蛋白质代谢实验靛基质试验原理色氨酸酶色氨酸酶色氨酸色氨酸 靛基质靛基质（吲哚）（吲哚）玫瑰靛基质玫瑰靛基质（玫瑰吲哚）（玫瑰吲哚）对二甲基氨基苯甲对二甲基氨基苯甲醛醛靛基质试验硫化氢试验n原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。n培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基n结果：培养基 变黑 为阳性，不变黑为阴性n应用：常用于肠道杆菌的鉴定蛋白质代谢实验蛋白质代谢实验苯丙氨酸脱氨实验n原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱
44、氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。n培养基：苯丙氨酸琼脂n试剂：10三氯化铁n结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性n应用：多用于肠道杆菌的鉴定蛋白质代谢实验蛋白质代谢实验苯丙氨酸脱氨试验原理苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸脱氨酶苯丙酮酸苯丙酮酸10三氯化铁三氯化铁绿色化合物绿色化合物尿素酶试验n原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。n培养基：尿素培养基n试剂：酚红指示剂n结果：培养基变红：+培养基不变色n应用：肠杆菌科属间鉴定蛋白质代谢实验蛋白质代谢实验尿素酶试验原理尿素尿素尿素酶尿素酶氨氨+CO2培养基培
45、养基pH升高升高酚红呈碱性变色酚红呈碱性变色枸橼酸盐利用试验n原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。n培养基：枸盐酸盐培养基n试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色）n结果：培养基变蓝：+培养基不变色：n应用：肠杆菌科属间鉴别枸橼酸盐利用试验原理枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH下降溴麝香草酚蓝 呈碱性变色培养基变蓝培养基糖类代谢试验糖类代谢试验实验名称实验名称实验目的实验目的实验方法实验方法结果结果注意事项注意事项糖类发酵糖类发酵
46、试验试验 鉴定细菌鉴定细菌糖发酵培养基糖发酵培养基接种接种 、培养、培养颜色变化、颜色变化、产气产气无菌无菌氧化氧化-发酵发酵试验（试验（OFOF试试验）验）区分细菌的代区分细菌的代谢类型谢类型 穿刺接种、穿刺接种、培养培养 颜色变化颜色变化一支接种后滴一支接种后滴加溶化的无菌加溶化的无菌凡士林凡士林甲基红甲基红（MRMR）试验）试验 肠杆菌科内细菌肠杆菌科内细菌的鉴别的鉴别 接种葡萄糖蛋接种葡萄糖蛋白胨水培养基，白胨水培养基，3535培养培养2 23d 3d 红色为阳性，红色为阳性，桔红色为弱桔红色为弱阳性，黄色阳性，黄色为阴性。为阴性。V-P V-P试验试验 区别大肠杆菌区别大肠杆菌和产气
47、杆菌和产气杆菌 BarrittBarritt氏氏法法红色为阳性红色为阳性 -半乳糖半乳糖苷酶试验苷酶试验（ONPGONPG试验）试验）迟缓发酵乳糖迟缓发酵乳糖的细菌之快速的细菌之快速鉴定鉴定黄色为阳性黄色为阳性反应反应 大量接种培养物大量接种培养物 ONPGONPG试验溶液必试验溶液必须有适当的缓冲须有适当的缓冲 产生黄色素的细产生黄色素的细菌不宜做此试验菌不宜做此试验 蛋白质代谢试验蛋白质代谢试验实验名称 实验目的 实验方法 结果吲哚试验吲哚试验（靛基质试验）（靛基质试验）肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌的鉴定的鉴定纯培养物接种蛋白胨水纯培养物接种蛋白胨水培养基，培养基，3535培养培养24h24h
48、48h48h，沿管壁徐徐，沿管壁徐徐加入加入KovacKovac氏试剂或欧氏试剂或欧氏试剂氏试剂0.5ml0.5ml，分为两，分为两层，观察。层，观察。两层液体交界处出现红色两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。为阳性，无色为阴性。氨基酸脱羧氨基酸脱羧 酶试验酶试验通过检测细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，35培养14d培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照（无氨基酸）为黄色。精氨酸双水精氨酸双水 解酶试验解酶试验肠杆菌科的鉴定、假单胞菌属的鉴定 含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。指示剂颜色转为碱性时为阳性。即溴甲酚紫转为紫色，酚红
49、转为红色。苯丙氨酸脱苯丙氨酸脱 氨酶试验氨酶试验 肠杆菌科 细菌被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。蛋白质代谢试验蛋白质代谢试验实验名称实验名称 实验目的实验目的实验方法实验方法结果结果硫化氢硫化氢试验试验 检测细菌对检测细菌对含硫化合物含硫化合物分解能力分解能力待检菌接种三糖铁培待检菌接种三糖铁培养基，养基，3535培养培养1-2d1-2d。醋酸铅试纸培养基醋酸铅试纸培养基培养基变黑色为阳培养基变黑色为阳性。性。试纸呈黑色试纸呈黑色为阳性。为阳性。明胶明胶液化试验液化试验检测细菌能检测细菌能否液化明胶否液化明胶将待检菌穿刺接种于明将待检菌穿刺接种于明胶培养
50、基，胶培养基，2020培养培养5 57d7d，观察。，观察。半固体培养基不再凝半固体培养基不再凝固为阳性。固为阳性。尿素酶尿素酶 试验试验肠杆菌科的肠杆菌科的鉴定鉴定将待检菌接种于尿素培将待检菌接种于尿素培养基，养基，3535培养培养1824h1824h时，观察结果，阴性应时，观察结果，阴性应继续观察继续观察4d4d。培养基变红为阳性，培养基变红为阳性，不变为阴性不变为阴性碳源和氮源利用试验碳源和氮源利用试验 实验名称实验目的实验方法 结果柠檬酸盐柠檬酸盐利用试验利用试验常用于肠杆菌科细菌的鉴定。被检菌接种于柠檬酸盐琼脂平板上，35培养14d，观察。培养基由淡绿色变为深兰色为阳性，不变色为阴性
