1、EGFPEGFP在大肠杆菌在大肠杆菌EcoliEcoli中的表达和检测主题中的表达和检测主题讲座讲座一一二二三三四四五五背景介绍背景介绍实验流程实验流程实验步骤实验步骤预期结果预期结果 参考文献参考文献contents2EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章一、背景介绍l 1、绿色荧光蛋白（GFP）l 2、质粒l 3、大肠杆菌表达载体及表达系统l 4、SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测3EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现GFP发光的遗传标签科研4EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题
2、讲座1 -绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP）1.1发现5EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座GFP 的分子质量为26 kDa，晶体结构如左图所示。蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从该螺旋开始，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6567位的“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”自身环化和氧化形成。1 -绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP）1.2特性6EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座GFP在紫外
3、光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395 nm，另一小吸收峰为470 nm，最大发射峰为505 nm。1 -绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白1.2特性7EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白1.2特性优点：易于检测，荧光稳定，无毒害，通用性，易于构建载体，活细胞观察8EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白1.3应用9EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.1pEGFP-N3质粒10EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.1.1 pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N
4、3 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP(13)which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells.(Excitation maximum=488 nm;emission maximum=507 nm.)pEGFP-N3 encodes the GFPmut1 variant(4)which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Le
5、u and Ser-65 to Thr.The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences(5).Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation initiation site(6)to further increase the translation efficiency in eu
6、karyotic cells.The MCS in pEGFP-N3 is between the immediate early promoter of CMV(PCMV IE)and the EGFP coding sequences.Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no intervening stop codons.SV40 polyade
7、nylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3 end of the EGFP mRNA.The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen.A neomycin resistance cassette(Neor),consisting of the SV40 early promoter,the neomyci
8、n/kanamycin resistance gene of Tn5,and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase(HSV TK)gene,allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418.A bacterial promoter upstream of this cassette expresses kanamycin resistance in E.coli.The pEGFP-N3 backbone
9、 also provides a pUC origin of replication for propagation in E.coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.11EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用Fusions to the N terminus of EGFP retain the fluorescent properties of the native protein allowing the localization of the fusio
10、n protein in vivo.The target gene should be cloned into pEGFP-N3 so that it is in frame with the EGFP coding sequences,with no intervening in-frame stop codons.The inserted gene should include the initiating ATG codon.The recombinant EGFP vector can be transfected into mammalian cells using any stan
11、dard transfection method.If required,stable transformants can be selected using G418(7).pEGFP-N3 can also be used simply to express EGFP in a cell line of interest(e.g.,as a transfection marker).12EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp1394bp13EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座pEGFP-N3质粒是一个用于在
12、哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码GFPmut1突变体，发生了两个氨基酸的替换。2-质粒质粒2.1.4 pEGFP-N3的EGFPLeu Phe-64 Ser-65 Thr 荧光强度增加了35倍14EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.1.5 编码EGFP的基因片段 6751394bp 长度720 bp651 GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT 700701 CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750751 ACAAGT
13、TCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800801 CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850851 CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900901 CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950951 TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC10001001 CCGCGCCGAGGTGAAGTTC
14、GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGC10501051 TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG11001101 GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA11501151 GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA12001201 GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC12501251 CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
15、TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG13001301 CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA13501351 CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGC 14001401 CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT145015EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.2pET28a质粒16EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.2.1 pET28a质
16、粒描述The pET-28a-c(+)vectors carry an N-terminal HisTag/thrombin/T7Tag configuration plus an optional C-terminal HisTag sequence.Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention,so the T7 expression region is reversed on the circular map.The cloning/
17、expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below.The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single-stranded DNA that corresponds to the coding strand.Therefore,single stranded sequencing should be performed using
18、 the T7 terminator primer(Cat.No.69337-3).17EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.2.2 pET28a质粒图谱卡那霉素抗性卡那霉素抗性18EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒质粒2.2.2pET28a质粒图谱19EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌表达系统如下：T7表达系统：T7噬菌体RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的35倍 Lac表达系统
19、是-半乳糖甘酶编码基因lac Z的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导 PL表达系统是负责 DNA分子转录的启动子之一，是一种很强的启动子一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成。20EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；
20、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。21EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.3原核表达载体选择标志的编码序列可控转录的启动子转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)一个多限制酶切位点接头宿主体内自主复制的序列22EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验
21、表达系统宿主菌载体筛选启动子融合标签BL21(DE3)pET28a卡那霉素T7 lacHis-Tag T7-Tag23EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。而BL21（DE3）就是一株由LacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌pET28a是具有His标签，利用T7 RNA聚合酶系统在大肠杆菌中诱导型高效表达外源蛋白的表达质粒，外源
22、基因可与N端的His标签或者T7标签融合，以提高外源基因的表达量。24EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.5宿主菌的表达25EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理26EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理27EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章二、实验流程28EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点实验流程实验流程大肠杆菌E.coli DH5阳性克隆转化BL21(DE3
23、)IPTG诱导表达SDS-PAGE分离检测29EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章三、实验步骤30EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章扩增菌株提取质粒 EGFP基因的PCR扩增和回收EGFP基因和pET28a载体的双酶切pET28a-EGFP重组表达载体的构建EGFP基因的原核表达与检测SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质31EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座(含pEGFP-N3和pET-28a的大肠杆菌DH5)（1）固-液接种：从LB平板上挑取含有以上质粒的E.coli DH5单菌落，接种于5mL LB培养基中，37 振荡培养过夜。（2）
24、液-液转接：以1%接种量将过夜培养的E.coli DH5接种于新鲜LB培养基中，37，220 rpm振荡培养22.5h。1-扩增菌株及提取质粒扩增菌株及提取质粒1.1扩增菌株32EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座（1）取1.05.0 mL的菌液，室温下13000 rpm离心1 min收集细菌。（2）倒弃培养基，加入250 L Solution/RNase A混合液，涡旋振荡使细胞完全悬浮。（3）往重悬混合液中加入250 L Solution，轻轻颠倒混匀46次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5 min。（4）加入250 L Solution，温和颠倒数次至形成白色絮状
25、沉淀。（5）室温下，13000 rpm离心10 min。（6）转移上清液至套有2 mL收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，13000 rpm离心1 min，倒去收集管中的滤液。（7）把柱子重新装回收集管，加入500 L HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。（8）把柱子重新装回收集管，加入700 L DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液（注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释）。（9）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13000 rpm离心空柱2 min以甩干柱子基质（注意：不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关
26、重要）。（10）把柱子装在干净的1.5 mL离心管上，加入50 L Elution Buffer到柱子基质中，静置1 2min，13000 rpm离心1 min，洗脱出DNA。1-扩增菌株及提取质粒扩增菌株及提取质粒1.2提取质粒（pEGFP-N3、pET28a）33EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增34EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增35EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGF
27、P基因的PCR扩增36EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增37EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增EcoR（192）Hind（173）38EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增39EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增40EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座以pEGFP-N3中
28、的EGFP片段作为PCR反应的模板，设计引入Eco R I酶切位点的上游引物(5-GGA GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3)和引入Hind 酶切位点的下游引物(5一CCG AAGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3)2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增产物5GGA GAATTC ATG GTGTCA GCC AAGCTT CGG33CCT CTTAAG TAC CACAGT CGG TTCGAA GCC541EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1酶切位点分析选择重组
29、酶切位点的3个原则：1.读码框正确2.不能破坏载体或目的片段3.两个酶缓冲液相似，从而可以同时酶切 42EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1读码框分析GAA TTC ATG GTGTCA GCC AAG CTTCTT AAG TAC CACAGT CGG TTC GAA正常表达未发生移码43EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增编号组分加量（L）1dNTP mixture5.0210 x buffer5.03上游引物(10M/L)2.04下游引物(10M/L
30、)2.05模板4.0 6Taq酶1.0 7ddH206.0total 2544EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增预变性952min变性9530s退火58.730s延伸721min终延伸727min保存4 45EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增产物的检验及回收扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，用DNA纯化试剂盒回收后待用。（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取质量。（2）以0.1 g凝胶对应300 L的体积加入溶胶液P
31、N。50水浴放置10 min，其间不保持水浴温度不变并上下翻动离心管至胶完全融解。（3）将上一步得到的溶液加入到吸附柱中，吸附柱放入收集管，室温静置1 min，13000 rpm离心30 s，弃上清液。（4）加入700 L漂洗液Pw，13000 rpm离心60 s，弃上清液。（5）加入500L漂洗液Pw，13000 rpm离心60 s，弃上清液。（6）13000 rpm离心2 min，彻底除去漂洗液Pw。（7）取出吸附柱，置于室温数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（8）将吸附柱放人一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液应先在65水浴预热，体积
32、应大于30L），室温放置2 min，13000 rpm离心2 min。（9）然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤（8）。（10）经纯化回收的DNA置于-20保存。46EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.2EGFP基因的双酶切反应物体积/LEGFP片段1010buffer2EcoR 1Hind 1ddH206总计201.37保温1h2.65条件下处理20 min进行热失活3.经1%的琼脂糖凝胶电泳检验4.DNA纯化试剂盒纯化回收47EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.
33、3pET28a载体的双酶切反应物体积/LEGFP片段1010 buffer2EcoR 1Hind 1ddH206总计201.经1%的琼脂糖凝胶电泳检验2.DNA纯化试剂盒纯化回收线性质粒条带48EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.1连接反应1.16保温过夜成分加样量/LddH20310T4 ligase buffer1.0EGFP片段8pET28a210T4 连接酶149EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化感受态细胞的制备（1）固-液接种：从LB平板上挑取新活化的E
34、.coli DH5单菌落，接种于5 mL LB培养基中，37振荡培养过夜。（2）液-液转接：以1%接种量将过夜培养的E.coli DH5接种于新鲜LB培养基中，37 ，220 rpm振荡培养2 2.5 h。（3）菌液冰浴：将菌液置于冰浴中。（4）取两个无菌的1.5 mL离心管，各加入1.5 mL菌液，4 ，4000 rpm离心5 min，弃上清。重复上述操作，使每个1.5 mL离心管中收集3 mL培养液的菌体。（5）残留液体涡旋细胞，加800 L预冷的0.1M CaCl2，冰浴悬浮细胞。4 ，4000 rpm离心5 min，弃上清。（6）加入100 L预冷的0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，
35、冰浴20 min。（7）分装至50 L/管，感受态细胞制备完成（现用或者48 h内使用，4保存）50EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化涂布平板1 2 3 4 5 6 7 实验设组实验设组 感受态细胞（L/管）DNA（L）冰浴热击冰浴复苏培养基涂布平板（42）I试验组试验组 100连接物5.0 10 min 90 s 5 min LB：0.9 ml/管，0.5-1 h LB+kan50l 2 100l 2 150l 2 200l 2 II转化转化对照对照 50 Pbv2201.0 LB+kan50l 1 III细胞细胞对照对照
36、 50 LB+kan50l 1 LB50l 1 预留一个空白+kan平板。51EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化筛选37平板培养过夜后，挑选35个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-EGFP重组质粒的菌落进行质粒提纯。52EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座5-EGFP基因的原核表达与检测5.1转化表达宿主取1 L“pET28a-EGFP”重组表达质粒，转化至E.coli BL 21(DE3)感受态细胞，经37培养过夜。53EGFP在大肠杆菌Ecoli中
37、的表达和检测主题讲座5-EGFP基因的原核表达与检测5.2诱导表达目的基因（1）随机挑选10个阳性菌落克隆于含卡那霉素(50 g/mL)的LB液体培养液中。（2）37摇床培养至OD值为0.41。（3）取出3 mL样品作为未诱导对照，4000 rpm离心5 min，收集细胞冻存于-20。（4）剩下的样品继续加入100 mM IPTG储液至终浓度为0.5 mM，继续37摇床培养,然后分别在日光灯和紫外灯下照射。54EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品的准备制胶电泳染色脱色分析55EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-P
38、AGE凝胶电泳分离蛋白质6.1样品的制备（1）将诱导表达后的菌体重悬于100 L PBS中，分别进行超声裂解，每个样品超声23 s，处理2 min。（2）取超声后溶液适量留待制备菌体表达总蛋白质样品。4 12000 rpm离心10 min，分别获取超声上清和沉淀，然后超声上清，测蛋白质含量，调整浓度一致。超声离心后沉淀用适量PBS重悬。（3）将菌体表达的总蛋白样品、超声上清、超声沉淀各取20 L与5样品缓冲液在EP管中混合，放入100加热5 min。（4）常温离心10000 rpm，取适量上清准备上样。56EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质
39、6.2分离胶及浓缩胶的制备分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约3040min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。分离胶去离子水 3.5 mL4分离胶缓冲液（pH=8.8）2.5 mL丙烯酰胺储液（30）4 mLTEMED 10 L10AP 80 L 浓缩胶去离子水 2.3 mL4浓缩胶缓冲液（pH=8.8）1 mL丙烯酰胺储液（30）0.67 mLTEMED 10 L 10AP 50 L57EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.3凝胶电泳取80 ml 电极缓冲
40、液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80 V恒压20 min，120 V恒压2 h。58EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.4染色、脱色取电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.5 1 小时；之后，在脱色液中脱色1 h，观察目的蛋白表达情况。59EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章四、预期结果l 1、菌落PCR的结果 l 2、重组质粒的双酶切结果l 3、测序的结果l 4、EGFP基因的表达结果l 5、分生实验课上的实验结果60EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲
41、座第几点第几点1、菌落、菌落PCR的结果的结果PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后，可发现在靠近750 bp处有清晰条带，这便是阳性。61EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点3、测序结果、测序结果将PCR进行测序，正确结果应该与genebank序列完全一致，由此可以证明目的片段“EGFP”已正确连接到pET28a表达载体，并且核苷酸序列未发生任何碱基突变。63EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点4、EGFP基因的表达结果基因的表达结果加入IPTG诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图所示，说明目的基因在表达菌E.coli BL21中表达。如图所示在紫
42、外光下可以观察到菌体细胞发绿色荧光64EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果在6月5日、10日和12日的分生实验课上，我们进行了“EGFP、DsRed和YFP在E.coli中的诱导表达和检测”的实验，得到了一些实验结果，现进行实验结果分析如下：65EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果在本次实验中，我们向LB固体培养基平板中进行接种的表达菌株分别可以表达GFP基因、RFP基因和YFP基因，从而经过IPTG诱导后可以产生相应的荧光蛋白。6月10日下午
43、我们在平板上进行划线接种，接种工具可以使用灭菌后的牙签、棉棒以及灼烧后的接种环。我对两个平板进行接种。其中一个平板接种后的图案如下图所示。图中可以很明显地看出平板划线的痕迹。接种完成后将平板倒置放在37恒温培养箱中培养。66EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果6月12日下午我们从恒温培养箱中取出平板观察实验结果。观察发现，在我做的2个平板中，表达菌株在平板中生长状态良好，在日光下就可以看到平板上的绿色、红色和黄色的菌落颜色（实际上是大肠杆菌产生的荧光蛋白的颜色）。其中一个平板在6月10日接种了可以产生RFP的表达菌株，
44、6月12日观察发现该平板在日光灯下即可见红色菌落组成的图案，如下图所示。67EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果不过该平板不小心被捏碎，导致没有在紫外灯下观察和拍照。我只对另一个平板在紫外灯下进行观察和拍照，实验结果如下图所示。68EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果上图所示的平板中我只接种了可以产生GFP的表达菌株，从而在平板中可以产生绿色菌落。该平板在日光灯下便可见绿色菌落，在紫外灯下观察更加明显。在紫外灯的照射下，平板中的菌落发出绿色荧光
45、，非常明亮，可以清晰地看到平板中的图案。在6月10日的平板划线过程中，我花了很多时间对第一个平板进行划线接种，第二个平板只是简单地划线接种。但是很不巧的是6月12日第一个平板被捏碎导致没有在紫外灯下观察拍照，因此最终的实验结果只能呈现第二个平板图案。第二个平板的图案设计没有什么独特的地方，设计该图案的原因是我们宿舍有一个舍友叫邱伟，外号是伟哥，他的口头禅是“厉害！”。因此我就随手在平板上写下了“伟哥厉害”四个字。69EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果6月12日我们同时对GFP、RFP和YFP三种蛋白质进行SDS-PA
46、GE电泳检测。SDS-PAGE电泳的加样顺序如下面两表所示。泳道12345678910样品pET28a-3GFP-0GFP-1MGFP-3GFP-5RFP-5RFP-0RFP-1RFP-3样量20L20L20L10L20L20L20L20L20L20L泳道1112131415161718样品MpET28a-0pET28a-1pET28a-5YFP-1YFP-0YFP-3YFP-5样量20L20L20L20L20L20L20L20L70EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果12345678910SDS-PAGE电泳图（电泳
47、图（1）SDS-PAGE电泳结果如下所示：71EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果1112131415161718SDS-PAGE电泳图（电泳图（2）72EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果泳道4和泳道11中加的是marker，其SDS-PAGE电泳理论条带如右图所示。电泳后的marker中有7条带，指示的蛋白质大小分别是14.4 kDa、18.4 kDa、25.0 kDa、35.0 kDa、45.0 kDa、66.2 kDa和116.0 kD
48、a。在电泳图（1）和（2）中两个marker跑出的条带都较清晰，可以看到marker中7条指示条带，电泳效果较好。泳道12、泳道13、泳道1、泳道14加的是空载体pET28a分别培养0小时、1小时、3小时和5小时后的样品，从SDS-PAGE电泳图（1）和（2）中可以看到，这4个泳道中有若干条条带，这些条带的位置和亮度相近，都是表达载体自身的蛋白质电泳结果。在这三种荧光蛋白对应的条带位置处没有观察到相应的条带，说明不含荧光蛋白基因的表达载体无法产生荧光蛋白。73EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果泳道2、泳道3、泳道5和
49、泳道6加的是可以产生GFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、1小时、3小时和5小时后的样品。GFP的分子质量为26 kDa，处于marker 25.0 kDa和35.0 kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。理论上可以产生GFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的GFP越多，电泳后得到的GFP对应的条带越亮越宽。从图中可以很明显地看出，泳道2中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到GFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导表达的表达菌株不能产生GFP。泳道3、泳道5、泳道6中均有符合GFP对应条带位置的又宽又明亮的条带，而且条
50、带宽度增加亮度增加，这说明经IPTG诱导表达时间越长，表达菌株产生的GFP越多。74EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点第几点5、分生实验课上的实验结果、分生实验课上的实验结果泳道8、泳道9、泳道10和泳道7加的是可以产生RFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、1小时、3小时和5小时后的样品。RFP的分子质量处于marker 25.0 kDa和35.0 kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。泳道8中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到RFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导的表达菌株不能产生RFP。理论上可以
