1、结核病实验室诊断现状结核病实验室诊断现状1主要内容主要内容 一、患者发现一、患者发现 二、结核病控制对实验室的要求二、结核病控制对实验室的要求 三、结核病实验室诊断现状三、结核病实验室诊断现状 四、结核病实验室存在的问题四、结核病实验室存在的问题 五、结核实验室诊断的主要难题五、结核实验室诊断的主要难题 六、十二五结核病实验室建设六、十二五结核病实验室建设2传染传染/传播性强传播性强并发症并发症/合并症合并症 发现难发现难症状隐匿症状隐匿/多样多样3结核病流调-疫情显示 人群筛查人群筛查4一、患者发现一、患者发现2012年全国结防机构登记活动性肺结核患者894199例,登记率66.37/10万
2、，涂阳患者358149例（占40.05%，登记率为26.58/10万），涂阴患者508620例（占56.88%）未查痰2073例（占0.23%），结核性胸膜炎25357例（占2.84%），与2011年相比涂阳减少65681例，涂阴增加53960例2012年登记的耐多药肺结核患者共2731例5患者发现患者发现 2012年全省结防机构登记活动性肺结核患者47334例,登记率82.70/10万，涂阳患者21339例（占45.08%，登记率为37.28/10万），涂阴患者25731例（占54.36%），未查痰,12例（占0.03%），结核性胸膜炎252例（占0.53%），与2011年相比涂阳减少481
3、2例，涂阴增加5427例 2012年湖北省登记耐多药肺结核患者210例 6患者发现患者发现 据WHO估算,每年新发MDR-TB患者50万，XDR-TB 5万，目前检测到的耐多药结核病病例仅占全球负担的5%，广泛耐药结核病（XDR-TB）则更低 依据我国第5次结核病流行病学调查结果。我国结核病患者中涂阳患者占144(1181310)，菌阳(涂阳或培阳)患者占265(3471310)，菌阴患者占735(9631310)根据07-08耐药监测结果估算，我国每年新发MDR-TB患者12.1万，XDR-TB 1万 提示虽然实验室发现了大量患者，但诊断技术与能力仍然缺乏 7二、结核病控制对实验室的要求二、
4、结核病控制对实验室的要求 结核病正确诊断是发现、治疗和管理结核病患者的基础。实验室诊断起着重要的作用,特别是细菌学诊断 WHO1995年把DOTS策略作为全球结核病控制策略，肺结核症状可疑者使用痰涂片检查发现传染性患者是DOTS策略5要素之一 2005年提出的遏制结核病策略，仍然将采用细菌学方法发现患者作为要素之一，并提出协作研发新型诊断技术8对实验室的要求对实验室的要求 当前,抗酸菌涂片镜检、结核分枝杆菌分离培养和药物敏感性试验等常规方法仍然是发达国家和发展中国家细菌学诊断的主要方法，它不仅是发现传染源的最主要手段，也是确诊结核病、选择治疗方案、考核疗效以及评价防治效果的可靠指标9对实验室的
5、要求对实验室的要求 目前的常规实验室方法虽各有长短,但总体上仍不能满足结核病诊断的要求。快速、准确、简便和低廉的实验室诊断技术一直是人们不知疲倦追求的目标。特别是，近年来人们将控制潜伏性感染或是临床前期感染作为控制结核病的早期策略之一，这些对实验室工作提出了较高的要求10对实验室的要求对实验室的要求 在发达国家,由于结核病疫情低，具有特征性的持续咳嗽、发热等症状已经不再是疑似结核病的可疑症状，在这些国家需要:能够在高危险人群中确定潜伏性感染的方法 能够替代x线光片和痰涂片来发现移民和其他高感染风险人群中活动性结核病的措施 能够替代传统培养方法的早期诊断手段 能够快速便捷的区别医源性感染和社区获
6、得性感染的指纹分析手段 能代替生化方法来进行菌种鉴定的新技术。11对实验室的要求对实验室的要求 在发展中国家,尤其是结核病高负担国家，结核病暴露史已经很难进行确定和评估，一些免疫学方法也在实验室诊断中起着一定的作用，如血清学方法，但是，广泛的卡介苗(BcG)接种和HIV感染影响了一些血清学方法的特异性。对于寻找快速、可信、简便的方法来替代现行的涂片显微镜检查的需求不很迫切，这些国家的需要倾向于:较传统培养方法更敏感、快速、简便的手段来诊断涂阴肺结核和无症状的结核病患者 在耐药结核病高流行国家需要快速、可靠、廉价的方法来发现耐药结核病患者 在HIV感染者中简便的筛查结核病患者的方法12三、结核病
7、实验室诊断现状三、结核病实验室诊断现状 1、发达国家的结核病实验室诊断现状 涂片常规镜检、分离培养和药物敏感性试验仍然是大多数发达国家临床实验室诊断技术的主流 与此同时一些快速诊断技术如基于液体培养的方法、核酸杂交、16s核糖体基因的测序、应用HPLc对细胞壁脂质(分枝菌酸)的分析、核酸扩增检测（NAAT),以及荧光原位杂交和噬菌体生物扩增技术等方法也成为他们的常规方法 免疫学检测方法也取得不错的结果，特别是干扰素释放试验在发达国家得到了较广泛的应用 测序技术在药敏检测中得到应用131、发达国家的结核病实验室诊断现状 基因分型技术在发达国家被广泛使用,主要方法有:限制性酶切片段长度多态性(IS
8、6110一RFLP)、数目可变的串联重复序列(VNTR)、分枝杆菌散在重复单位分型(MIRU)、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)，单核苷酸多态性分析(SNPS)、长片段多态性(LSP)以及缺失图谱等方法 在一定条件下可以追溯和确定传染源，鉴别未知传播，发现和鉴别培养的假阳性142、发展中国家结核病实验室诊断现状 从全球来看,结核病的高负担国家主要集中在发展中国家，由于经济发展程度所限，已经被使用了百余年的痰涂片显微镜检查技术和分离培养技术仍然是发展中国家结核病实验室诊断体系中所采用的主要方法 尽管痰涂片显微镜检查在HIV高流行地区其灵敏度不是很高，但是其简便、价廉并能够检测出传
9、播意义更为重要的排菌患者 wHO在发展中国家仍然推荐使用涂片镜检作为结核病控制规划中患者发现的基本手段，在这些国家，只是在少数地区的实验室能开展分离培养和药物敏感性试验等153、我国结核病实验室诊断现状 我国结核病实验室诊断体系已经建立多年,总体上由三部分组成 第一，国家、省、地市和县级结核病控制体系中的实验室，对结核病控制工作做出了重要贡献，在体系中地市、县结核病实验室（包括近两年出现的定点医院实验室）当前以涂片镜检为主要技术手段，部分县市开展了培养，部分地市开展了药敏和分子生物学快速诊断技术16我国结核病实验室诊断现状 第二,结核病专科医院的临床细菌学实验室，开展涂片镜检、分离培养和药物敏
10、感性试验等较为全面的细菌学方法，也能采用快速培养、分子生物学技术及免疫学检测技术对于一些特殊病例进行鉴别诊断 第三，综合医院中的结核病实验室（很少有），很少开展或不常开展细菌学检查，多采用一些可靠性不高的免疫学检测进行实验室诊断17设备名称全球基金项目中盖结核病项目一期中盖结核病项目二期我省情况LED30个省89个地市908个县区1027台3个省4个地市 6个县区14台4个省4个地市25个县区46台全覆盖Hain30个省89个地市125台（NTRL1台）4个省4个地市 4台2个省2个地市 5台（NTRL1台）省本级及4地市共5台Genechip无4个省4个地市 4台1个省1个地市 3台省本级及
11、4地市共6台GeneXpert30个省89个地市865个县区934台2个省3个地市 4个县区尚未采购省级及全球基金项目县共39台新型检测技术应用情况新型检测技术应用情况-1设备配备情况18 设备配备情况其他 达米恩项目:为贵州贵阳、青海西宁地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜 梅里埃项目：为广西柳州、新疆喀什地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜 省级经费：液体培养自动化检测系统：北京、上海、河南、浙江等液体培养自动化检测系统：北京、上海、河南、浙江等 LED荧光显微镜：湖北、山东、浙江等荧光显微镜：湖北、山东、浙江等 基因芯片：湖北基因芯片：湖北新型检测技术应用情况新型检测技术应用情况-219
12、中盖项目试点地区新诊断技术组合模式镇江市Hain组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进行诊断，并对涂阴患者做培养；地市级对涂阳的痰标本或涂阴培阳的菌株开展Hain耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。宜昌市Genechip组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进行诊断，并对涂阴患者做培养；地市级对涂阳的痰标本或涂阴培阳的菌株开展Genechip耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。汉中市Hain组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进
13、行诊断；地市级对涂阳的痰标本开展Hain耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。新型检测技术应用情况新型检测技术应用情况-320关于关于Hain和基因芯片的建议和基因芯片的建议 适用于地区及以上级实验室适用于地区及以上级实验室 仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测 操作需要至少有操作需要至少有3个独立的实验室以避免交叉污染个独立的实验室以避免交叉污染 仅能检测仅能检测MDR,XDR的检测仍需要依靠传统药敏试验的检测仍需要依靠传统药敏试验 可以独立作为可以独立作为MDR的诊断
14、工具的诊断工具 对于对于MDR病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养）病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养）检测治疗效果（培养阴转）检测治疗效果（培养阴转）临床报告必须取得省级临床检验中心颁发的临床报告必须取得省级临床检验中心颁发的临床基因临床基因扩增实验室扩增实验室许可证许可证 建议的覆盖面建议的覆盖面:每每50100万人口至少需要万人口至少需要1个个LPA实验实验室或基因芯片实验室，就我国目前实际情况室或基因芯片实验室，就我国目前实际情况100万人口万人口地市的级建立一个相应实验室是可行的地市的级建立一个相应实验室是可行的21Xpert MTB/RIF 检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药
15、直接标本检测 100分钟可获得结果22WHO关于关于Xpert MTB/RIF的的建议建议 Xpert MTB/RIF 应该用于怀疑MDR-TB的病人、以及HIV合并结核的病人的最初诊断（强烈推荐）Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分严重的地区,可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测（根据具体情况推荐，需考虑当地的资源）23说说 明明 WHO在“201 1年全球结核病控制报告”中对该试剂的评估结论为:单次XpertMTBRIF检测可检出99的涂片阳性(简称涂阳)和80的涂片阴性(简称涂阴)肺结核病患者。但有文献报道,单次XpertMTBRIF
16、检测涂阴培阳样本的检出率分别为725和769。由于涂阴患者包括涂阴培阳、涂阴和培养阴性(简称培阴)两种类型，而涂阴培阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者，因此，该报告中XpeftMTBRIF的MTB涂片阴性患者阳性检出率较实际值偏高24说说 明明 涂阴特别是涂阴培阴患者的诊断有进一步探讨的必要,根据该检测试剂公开发表的数据，该试剂的敏感度研究均以培养或涂片阳性作为判断标准。涂阳培阳样本检出率为998，培阳样本的检出率也高达90，具有高敏感度。根据我国第5次结核病流行病学调查结果，以我国痰菌阳性(简称菌阳)患者占患者总数264进行推算，该试剂的理论检出率仅为237;我国结核病涂阴培阴患者占患者总数
17、的73625说说 明明 Xpert MTB/RIF适用于痰标本（包括去污染后的痰标本）,肺外标本应用 Xpert MTB/RIF 的研究十分有限。增加检测次数可能会增加Xpert MTB/RIF的敏感性，但是需要考虑资源情况 上述建议也适用于儿童 不能取代传统的涂片检查、培养和药敏试验（治疗监测、流行病学调查、其他一线药物以及二线药物的药敏试验）在MDR低风险组（如新病人）Xpert MTB/RIF检测结果为利福平耐药者，建议用传统药敏试验或LPA进行确认2627 新检测技术验证评估与应用 完成评估 国产环介导核酸等温扩增试剂盒新型检测检术应用情况新型检测检术应用情况-428其他正在开发或评估
18、的新技术其他正在开发或评估的新技术方法方法商品商品检测目的检测目的流体芯片法MDR-TB检测荧光定量PCR溶解曲线法检测MDR-TB/XDR-TBMODS（显微镜观察药敏实验）无商品化试剂盒检测分枝杆菌的药物敏感性噬菌体生物扩增法诊断结核感染及药物敏感性新的固体药敏方法硝酸盐还原试验（无商品化试剂盒）诊断菌株对异烟肼和利福平的敏感性薄层琼脂培养法（无商品化试剂盒）诊断结核感染以及对异烟肼和利福平的敏感性颜色指示方法刃天青法（无商品化试剂盒）检测菌株对利福平和异烟肼的敏感性29分子水平分子水平 线性探针杂交（LiPA）基因芯片法（Genechip）多重连接再扩增（MLPA）变性高效液相色谱（DH
19、PLC）质谱（MALDI-TOF MS）焦磷酸测序（Pyrosequencing）实时PCR（Real-time PCR）线性探针（V2)多色巢式荧光定量(GenXpert)分子诊断技术30免疫学诊断免疫学诊断 结核菌素试验:用于流调、卡介苗接种、筛查、临床诊断与鉴别诊断,但PPD有多种分枝杆菌的蛋白成分，因而特异性差，且结果观察不便 结核抗体测定：结核抗原测定：能早期检测，技术简便快捷，但难以获得高特异性的抗体，目前尚缺乏结核抗原检测试剂 细胞因子检测：31免疫学诊断免疫学诊断 结核抗体测定:结核分枝杆菌感染机体,患者或有特异性IgG、IgM、IgA形成，联合检测可提高灵敏性 优点:简便快速
20、，有一定的敏感性和特异性，对结核病的诊断与鉴别诊断有参考价值 缺点：假阳性较高，没有单一抗原被所有患者识别32 总的来说，结核病患者的抗体反应是不完全相同的，要求设计一个由多种抗原组成的鸡尾要求设计一个由多种抗原组成的鸡尾酒式的结核病血清学诊断试验。酒式的结核病血清学诊断试验。具有灵敏度高和特异性强的结核病血清学诊断试剂要求由多种抗原的混合体构成 因此以后的研究方向是筛选各种特异性强、灵敏度高的抗原组成混合抗原，研制结核病血清学诊断试剂。有很多研究者已经进行或正在进行这方面的研究，相信在不久的将来这种研究成果可以应用于临床，服务于结核患者免疫学诊断免疫学诊断331个决定性因素-抗原脂阿拉伯甘露
21、聚糖（脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原）抗原敏感性敏感性 63%;特异性特异性 92.4%关于关于4种抗原的学术研究进展种抗原的学术研究进展34免疫学诊断免疫学诊断 细胞因子检测 细胞因子:是由细胞分泌,影响细胞生物学行为、调节免疫功能和对炎症反应的一类物质，被广泛研究的有TNF-（肿瘤坏死因子-）、白细胞介素和干扰素等 肿瘤坏死因子-参与了结核病的发病过程，与结核病产生的炎症反应程度有关，为重要的前炎症因子和免疫调节因子。国内研究表明，结核病活动期患者血清TNF-水平较健康对照组明显升高35免疫学诊断免疫学诊断-干扰素释放试验:目前研究认为：一、特异性高,不受卡介苗和非结核分枝杆菌的干扰，同时
22、也不受能导致类结核症状的其他病原的影响 二、敏感性好，特别是对菌阴肺结核和肺外结核有90%以上的检出率 三、非人体试验，不随访，结果判断客观 四、检测到-干扰素浓度的高低认为与体内感染结核杆菌的载量多少相关 五、无法区分是否活动性结核，在高流行地区，检测阴性结果排除结核的意义更大 六、价格高，广泛应用有一定的难度36四实验室存在的问题四实验室存在的问题 1、结核病防治体系的变革,为结核病实验室网络建设提出了新课题 疾控中心结核病实验室能力 出现弱化现象:职能定位不清，责、权、利不明，人员减少，设施、设备缺乏，无日常工作，熟练度不能保证，新技术推广无经费及基础 定点医疗机构结核病实验室工作处于初
23、始阶段，医院对实验室定位不清，资质不完备，实验条件不够，人员不够、能力欠缺，相关检测项目收费局限，开展检测项目意愿不高，质量意识薄弱37存在的问题存在的问题 2、实验室生物安全问题:根据我国病原微生物实验室生物安全管理条例和实验室生物安全通用要求的规定,卫生部印发的人间传染的病原微生物名录的要求，对于结核分枝杆菌大量活菌操作须在符合生物安全三级(BsL_3)的环境中进行，而对于样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PcR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动，可以在符合生物安全二级(BsL_2)的环境中进行，许多实验室不能达到生物安全的要求38存在的问题存在
24、的问题 3、合格实验标本的采集 4、实验室人员结构和能力建设 5、适应现在需要的结核病实验室检验规程、规范的编印出版及推广应用不够,造成实验结果的可靠性和互认程度不高39 6、新技术的评估、选择和应用 新技术评估,对照标准选择的科学性存在偏差 新技术应用存在某些限制因素 硬件设施的要求、资质的要求、人员能力 费用较高 与传统技术相结合 7、整体应急能力较弱 缺乏快速、准确的储备技术存在的问题存在的问题40 8、质量保证体系的建立和完善 传统方法质量保证体系还有待进一步完善和在疾控及医疗系统的推广及应用的 分子生物学等新技术、新方法的质量保证体系尚待建立 新技术设备/试剂,评估，推广应用后迫切需
25、要有效的质量保证体系9、整体科研能力有待于提升 基础性研究 实施性研究存在的问题存在的问题41五结核实验室诊断的主要难题五结核实验室诊断的主要难题 1涂阴肺结核实验室诊断、潜伏感染(Latent TB infection,LTBI)的诊断、没有简便、准确、可靠、单一的方法 2、结核合并HIV 感染患者诊断困难，结核病是 患者最常见的感染性疾病，也是 最常见的死亡原因。可促使结核病发病，感染后易迅速发展，播散，死亡率极高，同时由于患者免疫功能缺陷，实验室诊断效率较低 3、MDRTB和XDRTB的产生与流行，凸显出对结核病进行快速、有效诊断和治疗的重要性42主要难题主要难题 4、小儿结核与老年结核
26、病诊断困难小儿结核的一个最大特点是带菌量少,细菌学检测方法不易检出，的小儿结核患者细菌学检查呈阴性，若合并感染，则诊断更难;老年结核诊断难的主要原因是临床表现不典型，常合并其他严重疾病而掩盖了结核病情，同时免疫功能低下也使实验室诊断方法（如）应用于老年结核诊断时，检测灵敏度一般都较低43主要难题主要难题 5肺外结核诊断困难肺外结核病发生在肺部以外各部位,如不及时诊断治疗会造成脏器功能受损，甚至危及生命。其诊断困难的原因有:患者的病情往往被其他病症所掩盖，就诊时极易误诊，如脑结核易误诊为脑膜炎等;病灶取材不方便，难以获得细菌学证据；相当大一部分肺外结核患者免疫功能低下或缺陷，很多实验室诊断方法使
27、用时灵敏度较低 6 突破性的结核病实验室诊断新技术44六、十二五结核病实验室建设与发展规划六、十二五结核病实验室建设与发展规划 目的目的 建立健全全国结核病实验室网络服务体系,提高各级结核病实验室服务质量和水平,提高结核病的早期、快速诊断能力45十二五结核病实验室总体目标十二五结核病实验室总体目标1、100%的省级参比实验室具备分子生物学诊断和快速菌种鉴定能力2、100的地（市）级实验室具备药物敏感性试验能力3、80的区（县）级实验室具备分枝杆菌培养能力4、县级以上医疗机构的结核病实验室纳入网络服务体系,建立全国结核病实验室网络信息服务平台46结核病实验室主要工作指标结核病实验室主要工作指标1
28、结核病实验室生物安全二级（BLS2）达标率:2011年,100%的省级结核病实验室达到BLS2，地（市）级和（区）县级从2011年开始，每年递增20，至2015年达到100%2省级结核病实验室计量认证达标率:2011年达到10，逐年递增20，2015年达到903省级结核病实验室ISO 15189或ISO 17025认证达标率:2011年达到10%,逐年递增10，2015年达到504实验室质量保证:至2015年，省级实验室和地（市）级实验室的抗结核药物敏感性试验室间质量评估覆盖率均达到90%;至2015年，100县级以上医疗机构结核病实验室检测纳入国家结核病实验室质量保证体系47各级实验室的职能
29、及要求各级实验室的职能及要求 县区级结核病实验室职能及要求 地市级结核病实验室职能及要求 省级结核病实验室职能及要求48县区级结核病实验室职能及要求县区级结核病实验室职能及要求 职能 涂片、培养、督导 方法 涂片、培养的标准化操作流程 房屋 最少两间 设备、设施 生物安全柜、显微镜、恒温培养箱、冰箱、高压灭菌器等;人力资源 2-3人49地市级结核病实验室职能及要求地市级结核病实验室职能及要求 职能:涂片、培养、药敏试验、菌种鉴定、督导、培训、质控,有条件的地市开设快速诊断方法;房间：至少3间，如开展快速检测方法还应有适宜的、按照功能分区的基因扩增实验室；设备、设施：生物安全二级、三级实验室，有
30、开展传统检测方法的必须设备，开展快速检测的，应有基因扩增和相应的检测设备；人力资源：至少5人50省级结核病实验室职能及要求省级结核病实验室职能及要求 职能:规划省级实验室工作,制定省级网络建设和发展计划。开展传统和快速检测方法并进行相应的督导、质控和技术指导工作，接受国家级及跨国参比室的各项质控。房间：至少5间，面积不少于150平方米。设备、设施：生物安全二级、三级实验室，有开展传统检测方法的必须设备，开展快速检测的，应有基因扩增必需的区域和相应的设备;人力资源：至少10人51全国结核病实验室网络全国结核病实验室网络国家结核病参比室国家结核病参比室卫生部临检中心卫生部临检中心省家结核病参比室省家结核病参比室省级临检中心省级临检中心地市实验室地市实验室县市实验室县市实验室县市医疗机构结核病实验室县市医疗机构结核病实验室省级医疗机构结核病实验室省级医疗机构结核病实验室地市医疗机构结核病实验室地市医疗机构结核病实验室5253
