1、大肠杆菌培养分离大肠杆菌培养分离2一、大肠杆菌的概述一、大肠杆菌的概述大肠杆菌培养分离3菌落：菌落：n单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落形态结构的子细胞群体，叫做菌落。n菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。大肠杆菌培养分离4二、培养基二、培养基 培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制而成由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。液。1.1.培养基的营养物质培养基的营养物质2.2
2、.培养基的类型和用途培养基的类型和用途3.3.配制培养基的原则配制培养基的原则大肠杆菌培养分离51.1.无菌技术的概念无菌技术的概念 对实验操作空间、操作者的衣着和手进对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；避免已灭菌处理的操作应在酒精灯火焰旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。材料用具与周围的物品相接触。只有胆大心细，操作快捷，熟练、规范地进只有胆大心细，操作快捷，熟练、规范地进行无菌操作，才
3、可能成功地培养微生物。行无菌操作，才可能成功地培养微生物。大肠杆菌培养分离61 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁尔酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源3 3、紫外线消毒、紫外线消毒(1)(1)消毒的方法：消毒的方法：利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死大大部份致病微生物部份致病微生物的过程。的过程。大肠杆菌培养分离7（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微生微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉物
4、，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌之过程。之过程。大肠杆菌培养分离81 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌2 2、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min.3 3、过滤灭菌法、过滤灭菌法4 4、紫外光灭菌法紫外光灭菌法5 5、化学灭菌法、化学灭菌法(2)灭菌的方法：灭菌的方法：大肠杆菌培养分离91.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消
5、毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。大肠杆菌培养分离101 1计算计算、称量称量2 2溶化溶化3 3调调pHpH：pH7pH76 6操作步骤操作步骤大肠杆菌培养分离12 4 4灭菌灭菌:将将5
6、050mlml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为锅，在压力为100100kPakPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌15153030minmin。将培养基用旧报纸包裹，放入干将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在热灭菌箱内，在160160170 170 下灭菌下灭菌2 2h h。5 5倒平板倒平板:待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）近倒平板。（倒平板操作见课本）2 2d d后观察平后观察平板，
7、无杂菌污染才可用来接种板，无杂菌污染才可用来接种.(试管斜面的制作试管斜面的制作方法类似方法类似)6 6无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入3737的温室中培的温室中培养养24482448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。大肠杆菌培养分离13大肠杆菌培养分离14 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度？答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可感觉锥
8、形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。大肠杆菌培养分离152 2、大肠杆菌的扩大培养、大肠杆菌的扩大培养大肠杆菌培养分离163 3、分离大肠杆菌（除杂）、分离大肠杆菌（除杂）1 1、方法：、方法：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养
9、基的表面逐步稀释分散到培养基的表面.大肠杆菌培养分离17大肠杆菌培养分离18大肠杆菌培养分离19 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种接种环上残留的菌种
10、，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。免细菌污染环境和感染操作者。大肠杆菌培养分离20 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.
11、在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。大肠杆菌培养分离214.4.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？5.5.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程
12、中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板间的培养基上滋生
13、，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养微生物。大肠杆菌培养分离22大肠杆菌培养分离23玻璃玻璃三角三角刮刀刮刀大肠杆菌培养分离24下面是某校生物班同学在下面是某校生物班同学在“生物技术实践生物技术实践”课中进行的课中进行的实验，请回答：实验，请回答：（1）分离纯化土壤中细菌最常使用的接种方法是）分离纯化土壤中细菌最常使用的接种方法是 和和 两种。在接种过程中，对接种器械的灭菌方法两种。在接种过程中，对接种器械的灭菌方法是是 。（2）一同学在纯化土壤中细菌的实验中，发现其培养）一同学在纯化土壤中细菌的实验中，发现其培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是基上的菌落连成一片，最可能的原因是 ，应当，应当怎样处理？怎样处理？（2分）分）答案：（答案：（1 1）平板划线法）平板划线法 稀释平板涂布稀释平板涂布法法 灼烧灭菌灼烧灭菌 （2 2）菌液浓度过高）菌液浓度过高 增大稀释倍数（或培养过程被杂菌污染增大稀释倍数（或培养过程被杂菌污染 严格无菌操作；或用接种针划下一区域前接严格无菌操作；或用接种针划下一区域前接种针没有灭菌种针没有灭菌 每划一个新区域前都要对每划一个新区域前都要对接种针进行灭菌处理）接种针进行灭菌处理）大肠杆菌培养分离25
