1、医疗器械生物相容性医疗器械生物相容性1 相关概念生物相容性：生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能。医疗器械医疗器械：制造者专门或主要设计成为下列目的应用于人体的，不论是单独使用还是组合使用的，包括使用所需软件在内的任何仪器、设备、器具、材料或者其他物品。预期用于人体的任何材料或器械的选择与评价需遵循一定的评价程序。主要依据为：GB/T16886 ISO 10993在设计过程中，应对衡量各种所选材料的优缺点和试验程序进行判断并形成文件。为了保证最终产品安全有效地用于人体，这一程序应包括生物学评价。2标准分类医疗器材生物学评估架构与原则第1部分：评价与试验 材料特性与实质对等第7部分：环氧乙烷
2、灭菌残留量第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架第13部分：聚合物医疗器械的降解产物的定性与定量第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量第17部分：可沥滤物允许限量的建立第18部分：材料的化学特性第19部分：材料的物理化学、形态学和地形学特点3标准分类具体实验第2部分：动物保护要求第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验第4部分：与血液相互作用试验选择第5部分：体外细胞毒性试验第6部分：植入后局部反应试验第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验第11部分：全身毒性试验第16部分：降解产物和可溶出物的毒代动力学研究设计第20部分：医疗器械免疫学毒性试验原则和方法
3、4开始是否直接或间接接触？获得材料的识别信息并应考虑化学表征（ISO 10993-18）材料是否与市场上器械所用材料相同？与人体接触是否相同？是否有风险评定所需充分的论证和/或临床相关数据（化学和生物学）？这些数据是否与接触记录和途径相关？进行毒理学风险评定（附录B）根据材料的化学性质和接触类别和时间对器械进一步评价生物学评价完成是否是是否否否GB/T 16886.1 不适用器械是否有相同的化学组成？制造和灭菌是否相同？生物学实验的选择（附录A）试验和（或）豁免建议试验的论证是否材料中所有化学物的充分的毒理学数据？这些数据是否适用于化学混合物？是是是是是是是否否否否否医疗器械生物学评价流程5生
4、物学评价试验的选择6第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验遗传毒性试验遗传毒性试验：采用哺乳动物或非哺乳动的细胞培养或其他技术，测定由器械、材料和/或其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及DNA或基因的其他毒性。体外遗传试验：细菌基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞诱裂性试验体内遗传试验啮齿动物微核试验啮齿动物骨髓中期分析哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验注意：所有体外试验结果均为阴性，为避免对动物的过度使用，通常不再论证并不宜再进行动物遗传毒性试验。若全部体外试验的结果均为阳性，则应进行体内诱变性试验，否则推定该化合物为诱变物。7第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒
5、性试验细菌基因突变试验（AMES实验 his-his+）鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶（S9），可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。8AMES实验测试系统：细菌 鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型 埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型浓度设置：阴性对照
6、组/溶剂对照组；阳性对照组；受试物至少五个剂量组；决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。对原料而言：一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言：有杀菌作用，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液，最低剂量 为0.1g/皿。方法：平板掺入法（标准试验法）预培养法（提高测试灵敏度）点试法（预试验）9AMES实验-菌株特性鉴定组氨酸需求紫外线损伤修复缺陷脂多糖屏障丢失（rfa）R因子（抗氨苄青霉素、抗四环素）自发回变10AMES实验平板掺入法预培养法11AMES实验结果观察和判断：掺入法：以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试回变菌
7、落数增加一倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变阳性。点试法的判定：如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落与空白对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物为阳性，但应该用掺入法试验来确证。12第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验哺乳动物细胞基因突变试验（小鼠淋巴瘤细胞试验MLA tk+tk-）MLA是以抗药性的出现作为观察突变指标,其小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y tk+/-3.7.2C)的tk基因产物为胸苷激酶(TK)。该酶催化胸苷的磷酸化反应,生成胸苷单磷酸(TMP),进一步生成 DNA复制所必须的胸苷三磷酸。如果存在三氟
8、胸苷(TFT)等嘧啶类似物,则产生异常的 TMP,而异常TMP 的存在将导致细胞死亡。如在被检物存在下,细胞对TFT发生抗药性,则说明 tk 基因发生突变。试验细胞株的 tk+/-基因位于 11 号常染色体上,为杂合子基因,这样只需一侧的 tk+tk-即能对嘧啶类似物产生抗性。13小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）试验系统：小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/-细胞方法：软琼脂平皿法（soft agar method）在美国使用较多。在平皿中生长的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率（cloning efficiency，CE）和突变率（mutation frequency，MF）
9、等指标。微孔平板（microwell method）（即96孔培养板）法在欧洲使用较多。在微孔中生长的抗性突变细胞集落呈Poisson分布，根据实验结果可计算接种效率（plating efficiency，PE）和突变率等指标。优点：既能检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤缺点：自发突变率高，需要定期清除自发突变。14CellsExpression(2d)Chemical treatment(3h or 24h)Plating for PE0Plating for PE2Plating for TFTrIncubation(12d)Colony countingand calculation
10、Incubation(12d)小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）细胞集落形成率,即平板效率(Plating Efficiency,P E)的相对存活率(Relative Survival,RS)作为细胞毒性指标。15突变集落突变集落在TK基因突变试验中，经过TFT选择后长出的抗性细胞集落（即 tk-/-突变体）可分为两种类型，即大集落（集落）和小集落（集落）。微孔平板法：大集落微孔直径的1/4 小集落微孔直径的1/4软琼脂平皿法：大集落直径0.6mm 小集落直径0.6mm大集落呈弥散性生长，其密度低；小集落呈集中性生长，其密度高。一般认为大、小集落突变体是由于基因损伤的范围和程度不同所致。大集落突变
11、体的基因损伤多仅局限于 tk 位点；而小集落突变体是由较大范围的染色体改变（染色体断裂、缺失、重组或分离异常等）所致。这是TK基因突变试验能够检出基因突变和染色体畸变两类终点，并能在一定程度上对二者加以区分的重要机理。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）16试验结果的判定试验结果的判定 各处理组的MF值呈浓度依赖性升高，判定为阳性；MF值 阴性对照值+126，判定为阳性。（微孔法中的GEF=99+27=126）阳性对照参考值阳性对照参考值其一，阳性对照组总诱导率IMF至少30010-6，其中小克隆IMF至少12010-6其二，小克隆IMF至少15010-6满足上述标准之一，并且阳性对照相对总生长率（R
12、TG）10%结果评判结果评判小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）17第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验哺乳动物细胞诱裂性试验（体外哺乳动物细胞染色体畸变试验）在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。18体外哺乳动物细胞染色体畸变试验测试系统：中国地鼠卵巢（CHO）细胞株；中国地鼠肺（CHL）细胞株；人外周血淋巴细胞剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；阳性对照组；受试物至少三个剂量组；最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以
13、及pH或渗透分子浓度(osmolality)的改变。最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均应大于50%）。对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5l/mL，5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是：当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。19体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法：细胞复苏、培养；受试物处理；加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期；收获细胞，滴片空气干燥，染色处理条件：包括代谢活化和非代谢活化条件在处理后6和24小时收获细胞代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时20体外哺乳动物细胞
14、染色体畸变试验读片分析：有丝分裂指数毒性染色体结构畸变染色体数目畸变21a.染色单体断裂b.三辐射体 c.染色体断片 d.双着丝点染色体 e.环状染色体 f.无着丝点断片22啮齿动物微核试验微微核核试试验验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。最常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。以受试物处理啮齿类动物，然后处死，取骨髓，制片、固定、染色，于显微镜下计数PCE中的微核。如果与对照组比较，处理组PCE微核率有统计学意义的增加，并有剂量-反应关系，则可认为该受试物是哺乳
15、动物体细胞的致突变物。采用大鼠或小鼠（610周）分析骨髓中嗜多染红细胞中的微核，嗜多染红细胞是红细胞成熟的一个阶段，主核已排出，容易观察微核23微核是染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的细胞质内。24剂量设置：阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少三个剂量组；阳性对照组；试验方法给药临床拟用途径；预试验中测定时相点，确定正式试验的采样时间；收集骨髓细胞，离心，涂片，干燥，固定，染色啮齿动物微核试验25读片：嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光
16、滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。计数PCE/NCE（嗜多染红细胞/成熟红细胞）的比例反映毒性计数含微核PCE的细胞百分率；啮齿动物微核试验26第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验啮齿动物骨髓中期分析（哺乳动物骨髓染色体畸变试验）本试验是一项致突变性试验，检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。使哺乳动物（如大鼠或小鼠）经口或其它适宜途径染毒，动物处死前用细胞分裂中期阻断剂处理，处死后制备骨髓细胞染色体标本，分析染色体畸变。27第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅S期是DNA合成期。当
17、DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在其它细胞周期，称程序外DNA合成，即UDS，因此发现UDS增高，即表明DNA发生过损。在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低（充其量只有半保留DNA复制的5）的UDS。这可以用同步培养将细胞阻断于G1期并用药物（常用羟基脲）抑制残留的半保留DNA复制后显示。同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G1期。在这些半保留DNA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用3H-胸腺嘧啶核苷的掺入增加显示。它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测量。28第3
18、部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验致癌性：该试验是在试验动物的整个寿命期内，一次或多次将器械、材料和/或其浸提液作用于试验动物，测定其潜在的致肿瘤性。在单项实验研究中，该试验还可检验慢性毒性和致肿瘤性。只有在从其他方面获取到提示性资料时才进行致癌性试验，试验建议与接触途径和作用时间相适应。方法选择：OECD451致癌性研究OECD453慢性毒性、致癌性综合研究29第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验生殖与发育毒性：该试验评价器械、材料和/或其浸提液对生殖功能、胚胎发育（致畸性），以及对胎儿和婴儿早期发育的潜在影响。只有在器械有可能影响应用对象的生殖功能是才进行生殖/发育毒性试验或生物测定
19、。30生殖与发育毒性生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示：各段试验研究阶段如下：各段试验研究阶段如下：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B胚胎胎仔发育毒性试验（II段）：C-D围产期毒性试验（III段）：C-F31生殖与发育毒性实验动物：首选啮齿类动物为大鼠。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。剂剂量选择：量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。高剂量：应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。低剂量：应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量（NOAEL）”。给药途
20、径给药途径：应与临床拟用途径一致（不用腹腔注射途径，因腹腔注射会对胎儿及子宫产生直接影响）。对照组对照组：应设赋形剂对照组。当赋形剂可能产生作用或影响受试物的作用时，应另设空白对照组。32生育力与早期胚胎发育生育力与早期胚胎发育毒性试验（毒性试验（I段）段）33胚胎胚胎-胎仔发育毒性试胎仔发育毒性试验（验（II段）段）34围产期毒性试验（围产期毒性试验（III段）段）35第4部分 与血液相互作用试验选择该试验评价血液接触器械、材料或一相应的模型或系统对血液或血液成分的作用。特殊的血液相容性试验，还可设计成模拟临床应用时器械或材料的形状、接触条件和血流动态。溶血试验采用体外法测定由器械、材料和/
21、或其浸提液导致的红细胞溶解和血红蛋白释放的程度。36第4部分 与血液相互作用试验选择37第4部分 与血液相互作用试验选择38与血液相互作用试验选择39与血液相互作用试验选择4041第4部分 与血液相互作用试验选择42溶血试验目前国际上明确的、公认的用于评价医疗器械或医疗器械材料的溶血性能的方法主要有三种：NIH（National Institutes of Health，国家健康机构）法 ASTM（American Society for Testing and Materials，美国 材料与试验协会）F756-2008（适用于专项检验材料溶血性能（化学因素导致的溶血），不适宜用于整体医疗器
22、械）MHLW（日本劳动健康福利局）的溶血方法注意：注意：医疗器械不宜使用高度稀释的红细胞悬液来检测溶血性能，为使溶血性能标准化，还必须考虑到血细胞比容和其他因素。43 三种溶血试验方法比较44454647第5部分 体外细胞毒性试验体外细胞毒性试验采用细胞培养技术，测定由器械、材料和/或其浸提液造成的细胞溶解（细胞死亡），以及对细胞生长的抑制和对细胞的其他影响。优点：周期短、操作容易、再现性良好、可进行定量评定、对毒性物质敏感度高与价格便宜等样品制备方法：1）浸提液试验2）直接接触试验3）间接接触试验（包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验）48第5部分 体外细胞毒性试验评价方法：a)按形态学方法评价细
23、胞破坏（如显微镜检查、化学染色等）b)细胞损伤的测定（流式细胞术等）c)细胞生长的测定（MTT法，流式细胞术等）d)细胞代谢特征的测定（生化分析、酶活力测定等）49MTT法MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。50MTT法一、检测原理MTT（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体
24、中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm（或570nm）波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内成正比。二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60水浴助溶），用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na
25、2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4，定容1L）3、DMSO 4、96孔板 5、酶联免疫检测仪 6、细胞培养箱51MTT法三、MTT法实验步骤1、贴壁细胞（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100l,铺板使待测细胞调密度至103-104cell/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。（2）5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100l，设3-5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。（3）5%CO2，37孵育
26、16-48小时，倒置显微镜下观察。（4）每孔加入20lMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。（5）终止培养，小心吸去孔内培养液。（6）每孔加入150l二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。（7）同时设置调零孔（培养基、MTT、DMSO），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO）52MTT法2、悬浮细胞（1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序A.补足的1640（无血清
27、）培养基40l；B.加Actinomycin D 10l用培养液 C.需检测物10l；D.细胞悬液50l（即5104cell/孔），共100l加入到96孔板边缘孔用无菌水填充）；每板设对照（加100L 1640）。（2）置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。（3）每孔加入10 l MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）（4）离心（1000转10min），小心吸掉上清，每孔加入100 l DMSO，置摇床上低速振荡10 min，
28、使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。（5）同时设置调零孔（培养基、MTT、DMSO），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO），每组设定3复孔。53MTT法五、计算抑制率(对照-本底)-(给药-本底)/(对照-本底)*100%.54第6部分 植入后局部反应试验该试验是用外科手术法，将材料或最终产品的样品植入或放入预定的植入部位或组织内，在肉眼观察和显微镜检查下，评价对活体组织的局部病理作用。对一种材料来说，如还评价全身作用，该试验等效于亚慢性毒性试验。适用于评价亚慢性反应（短期，12周以内），或慢性反应（长期，12周以上）
29、。实验动物：皮下组织和肌肉内的短期试验：一般可选小鼠、大鼠、豚鼠和家兔皮下组织、肌肉和骨内的长期试验：一般可选大鼠、豚鼠、家兔、狗、绵羊、山羊、猪或其他寿命较长的动物中的一种。评价方法：肉眼观察评价及组织学评价55第10部分 刺激与迟发型超敏反应试验致敏：采用一种适宜的模型测定器械、材料和/或其浸提液潜在的接触致敏性。该试验较为实用。因为即使是少量的可沥滤物的使用或接触也能引起变应性或致敏性反应。刺激性：采用一种适宜的模型，在相应部位或在皮肤、眼、粘膜等植入组织上测定器械、材料和/或其浸提液潜在的刺激作用。要测定器械、材料及其潜在可沥滤物的刺激作用，试验的进行建议与使用或接触的途径和持续时间相
30、适应。皮内反应：评价组织对器械浸提液的局部反应。该试验适用于不适宜做表皮或粘膜刺激试验的情况（如连向血路的器械），还适用于疏水性浸提物。56第10部分 刺激与迟发型超敏反应试验刺激试验体外皮肤刺激试验：大鼠皮肤经皮电阻抗试验（TER）和EPISKIN试验（化学物皮肤腐蚀性的替代试验）体内皮肤刺激试验：影响因素：a)器械用于斑贴试验时的特性b)试验材料的剂量c)试验材料的应用方法d)封闭的程度e)接触部位f)接触时间和天数g)评价试验所采用的技术注意：试验材料的pH值如小于等于2或大于等于11.5，应认为是一种刺激物，不必进一步试验57第10部分 刺激与迟发型超敏反应试验58第10部分 刺激与迟
31、发型超敏反应试验迟发型超敏反应方法：豚鼠最大剂量试验（GPMT）预实验（为了确定主试验中所用试验样品的浓度）：1）为主试验的局部诱导阶段所选择的最高浓度可导致轻度红斑，但不对动物产生其他有害作用。2）为主试验的激发阶段选择的最高浓度不产生红斑用通用溶剂制备的未稀释的浸提液不需要进行预实验主试验：皮内诱导阶段局部诱导阶段激发阶段59第10部分 刺激与迟发型超敏反应试验皮内诱导A：注射CFA与选定溶剂以50:50比例混合的稳定乳化剂。水溶性材料溶剂选N.SB:注射试验样品，对照组注射溶剂C:试验样品以50:50的比与FCA和溶剂（50%）配置成的稳定性乳化剂混合后进行皮内注射，对照组注射空白液体与
32、佐剂配置成的乳化剂60豚鼠最大剂量试验（GPMT）局部诱导阶段皮内诱导阶段7d（1d），按皮内诱导部位B中选定的浓度，采用面积约8cm2的敷贴片局部贴敷与每只动物的肩胛骨内侧部位，覆盖诱导注射点。如按皮内诱导的最大浓度未产生刺激反应，应在局部敷贴应用前24h 2h，试验区用10%十二烷基硫酸钠进行预处理，按摩导入皮肤，用封闭式包扎带固定敷贴片，并于48h 2h后出去包扎带和敷贴片。激发阶段局部诱导阶段后14d（1d），用试验样品激发全部试验动物和对照动物。按皮内诱导部位C中选定的浓度，将适宜的敷贴片或载样器皿置于试验样品或介质对照中浸透，局部贴敷与诱导阶段未试验部位。61第10部分 刺激与迟发
33、型超敏反应试验封闭式贴敷试验（Buehler试验）预实验（为了确定主试验中所用试验样品的浓度）：1）为主试验的局部诱导阶段所选择的最高浓度可导致轻度红斑，但不对动物产生其他有害作用。2）未主试验的激发阶段选择的最高浓度不产生红斑预期局部使用的医疗器械和采用通用溶剂制备的未稀释的浸提液不需要进行预实验主试验：诱导阶段激发阶段62诱导阶段按预实验选定的出现轻微红斑的试验样品最高浓度，将合适的敷贴片浸透试验样品，局部敷贴与每只动物的左上背部位。6h后除去固定器，封闭包扎带和敷贴片。1周中连续3d重复该步骤，同法操作3周。对照动物仅使用空白液同法操作。激发阶段最后一次诱导敷贴后14的（1d），用试验样
34、品对全部试验动物和对照动物进行激发。按预实验选定的不出现红斑的试验样品最高浓度，将合适的敷贴片浸透试验样品单独局部贴敷与每只动物去毛的未试验部位。6h后除去固定器，封闭包扎带和敷贴片。封闭式贴敷试验（Buehler试验）63第10部分 刺激与迟发型超敏反应试验其他刺激试验：皮内反应试验皮内反应试验眼刺激试验口腔刺激试验阴茎刺激试验直肠刺激试验阴道刺激试验64第11部分 全身毒性试验（包括热源反应）急性毒性：该实验将器械、材料和/或其浸提液在24h内一次或多次作用于一种动物模型，测定其潜在的危害租用。该试验适用于接触会导致有毒的沥滤物和降解产物吸收的情况。亚慢性毒性（亚急性毒性）：该实验在大于2
35、4h但不超过试验动物寿命的10%的时间内，测定器械、材料和/或其浸提液一次或多次应用或接触对试验动物的影响。有慢性毒性资料的材料可免做这类试验，免试理由建议在最终报告中说明。试验建议与器械实际接触途径和作用时间相适应。65第11部分 全身毒性试验（包括热源反应）热原可以引起病人发热反应。热原反应的来源有材料本身引起（material-mediated）、内毒素引起（endotoxin mediated）或其他物质引起（如革兰氏阳性菌与真菌的成分）。内毒素与非内毒素所致的热源物质试验材料本身或者其他物质引起的热原反应试验，现行的建议是采用兔子热原试验。LAL 试验法适用于内毒素所致的热原反应试验。66谢谢！欢迎指正！67
