1、目目 录录基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗培训教程培训教程目目 录录目目 录录F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础F第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断F第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断F第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断F第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 F第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 本章内容提要本章内容提要2基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录
2、录基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫地中海贫血进行诊断。血进行诊断。4基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是的方法。基因诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽。，也
3、可以是蛋白质或者多肽。5基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；从低到高；l基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。6基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性7基因诊断与
4、基因治疗培训教程目目 录录目目 录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）nDNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）n生物芯片（生物芯片（biochips）nWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 8基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（一）核酸分子杂交（
5、一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。新配对形成双链的过程。9基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针10基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 提取提取DNA限制
6、性内切酶消化限制性内切酶消化DNA以产以产生特定长度的片段生特定长度的片段凝胶电泳分离凝胶电泳分离 变性处变性处理理DNA转印到膜上并使其牢固结合转印到膜上并使其牢固结合将标将标记的探针与膜上记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信片段杂交，分析杂交信号。号。1.Southern 印迹杂交印迹杂交(Southern blotting)11基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。2.Northern印迹杂交印
7、迹杂交(Northern blotting)12基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3.斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。13基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 4.反向斑点杂交反向斑点杂交（reverse dot blotting）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品膜上，将样品RNA或或DNA标记变性后进行标记变性后
8、进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率诊断的效率。14基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大大提高检测结果的可靠性。大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleo
9、tide,ASO）15基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录5.5.原位分子杂交原位分子杂交n荧光原位杂交荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,FISH）n挂锁挂锁FISH (FISH with padlock)16基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）17基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 6.固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization)待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（片段（A、B片段），分别
10、作为捕捉探针（不标记片段），分别作为捕捉探针（不标记的的A片段）和检测探针（标记的片段）和检测探针（标记的B片段），同时与片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。18基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 19基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（二）（二）聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polym
11、erase chain reaction,PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火20基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用nRT-PCRRT-PCRn荧光定量荧光定量PCRPCRn多重多重-PCR-PCRnPCR-ASOPCR-ASOnAS-PCRAS-PCRnPCR-SSCPPCR-SSCPnPCR-RFLPPCR-RFLP21基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录1.RT-PCR22基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录2.荧光定量荧光定量PCR荧光标记引物荧光标记引物2
12、3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 3.多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR24基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录4.PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM25基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不片段中碱基序列
13、不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。26基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意27基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 28基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 （四）限制性片段长度多态性分析（四）限制性片段长度多态性分析 （restriction fragmen
14、t length polymorphism,RFLP）由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。29基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩扩增后用该限制酶切割增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶产物，
15、根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLP30基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化31基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（五）（五）DNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）32基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录DNA序列测定原理序列测定原理(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法)33基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于
16、基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究34基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（六）生物芯片（六）生物芯片（biochips）n基因芯片（基因芯片（gene chips）n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)35基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图36基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性
17、高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片37基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录三、三、基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分
18、子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。38基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知已知3
19、9基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变40基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 41基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替包括数十个碱基到数千个碱基的丢
20、失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。征）等。2.2.基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 42基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血4
21、3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）44基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3.基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析45基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基
22、因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测46基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 DNA多态性：多态性：指群体中的指群体中的DNA分子存分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记47基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录间接诊断：检测与致病
23、基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)48基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录7.6kb13kb患患者者正正常常 HBS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常
24、；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针49基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases50基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断 三、脆性三、脆性X综合征综合征
25、 51基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 52基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录n正常的（正常的（N）的）的ASO探针：探针：5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变的（突变的（M）的）的ASO探针：探针：5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者
26、基因诊断ASO杂交法杂交法53基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子54基因诊断与基因治疗培训教程5 3 正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)5 3 突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析目目 录
27、录55基因诊断与基因治疗培训教程0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目 录录56基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker5
28、7基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录1.PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I;1:未酶解片段；未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症58基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录-珠蛋白生成障碍性
29、贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.2.反向斑点杂交反向斑点杂交59基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录二、血友病（二、血友病（Hemophilia）n甲型血友病是由于血浆凝血因子甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。）缺陷造成。n甲型血友病的基因突变类型已有甲型血友病的基因突变类型已有300余种，余种，其中点突变占其中点突变占174种；另有部分患者是由于种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。的基因倒位所致。60基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录1.FVIII基因倒位的基
30、因倒位的DNA印迹分析印迹分析 将基因组将基因组DNA用用Nco I，Dra I或或Bcl I等内切酶等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和和16 kb三种三种类型。类型。I型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、17.5和和14 kb三种类型；三种类型；型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、16和和15.5 kb三种带型。在三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。61基因诊断与基因治疗培训教程目目
31、录录目目 录录2.FVIII基因突变的检测基因突变的检测（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析的连锁分析（2）RFLP连锁分析连锁分析（3）VNTR分析分析（4）短串联重复序列（）短串联重复序列（STR）的连锁分析）的连锁分析62基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性 X 智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定的定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。岛的异常甲基化。n正常人中约为正常人中约为
32、 850 拷贝。拷贝。n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG 岛岛未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突变（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。）。n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1 mRNA在在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。63基因诊断
33、与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用基因诊断方法1PCR-ASO 2DNA连锁分析连锁分析 3Souhern印迹杂交法印迹杂交法4PCR扩增扩增 64基因诊断与基因治疗培训教程 第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目 录录65基因诊断与基因治疗培训教程 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）HAV系系RNA病毒，利用病毒，利用RT-PCR技术可从粪便技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。n乙型肝炎病
34、毒（乙型肝炎病毒（HBV）设计保守区序列引物，扩增各型设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。，以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）HCV为正链为正链RNA病毒，先反转录成病毒，先反转录成cDNA，再，再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。目目 录录66基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病n结核分枝杆菌结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一技术扩增出一383 bp序列，再用探针序列，再用探针
35、杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）主要采用主要采用PCR技术：检测技术：检测HP染染色体色体DNA特异片段；检测特异片段；检测HP尿素酶尿素酶A基因；用基因；用PCR-RFLP鉴别鉴别HP菌株。菌株。67基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫 n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫n衣原体感染衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术 68基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis
36、 of Malignant Tumors69基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 70基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测原癌基因的检测 ras 基因家族由基因家族由H-ras、K-ras和和N-ras组成。最常见组成。最常见的突变是第的突变是第12、13、59或第或第61位密码子的点突变。位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第
37、突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为突变为TGT、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。突变为主。71基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 PCR 及及PCR-SSCP分析：分析：扩增扩增ras 基因第基因第12位密码子点突变部位，再用位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分技术进行分析，或者直接测序确定患者析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突原癌基因
38、的点突变。变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变。位密码子点突变。2.ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法72基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测 np53基因以密码子第基因以密码子第175位、第位、第248位、第位、第249位、位、第第273位及位及 第第282位点突变率最高。在结直肠癌、位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因基因蛋白。蛋白。np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （1）PCR-SSC
39、P分析技术分析技术 （2）DNA序列分析序列分析 （3）PCR-RFLP分析分析73基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（一）乳腺癌（一）乳腺癌 1乳腺癌常见基因变异乳腺癌常见基因变异 5%10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（基因（breast cancer gene）的突变。）的突变。BRAC1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。失或插入
40、导致编码序列的框移和翻译提前终止。BRCA1在在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危端截短则主要与乳腺癌高危有关。有关。BRCA2基因在基因在30%40%的散发性乳腺癌有杂的散发性乳腺癌有杂合性缺失（合性缺失（LOH）。突变提高乳腺癌易感性。）。突变提高乳腺癌易感性。二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断74基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（1）PCR法检测法检测BRCA1基因突变基因突变（2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（FISH）检测）检测BRCA2基基因扩增因扩增2乳腺癌基
41、因诊断方法乳腺癌基因诊断方法75基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（二）结肠癌（二）结肠癌 1.结肠癌常见基因变异结肠癌常见基因变异 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。APC（adenomatous polyposis coli）是结肠癌发）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。结肠癌形成的早期事件。DCC（deletion of colorectal cancer）基因失活）基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因D
42、PC4和和MADR2也可能会因也可能会因18q等位基因丢失而失活。等位基因丢失而失活。p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。DNA修复基因也与结肠癌有关。如修复基因也与结肠癌有关。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或或hPMS2基因的突变所致的基因的突变所致的DNA错错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断76基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录（1）PCR-SSCP法：法：对腺瘤样息肉病人对腺瘤样息肉病人APC基基因因PCR-SSCP技术进行分
43、析。技术进行分析。（2）异源双链）异源双链PCR法：法：检测检测APC基因变异。基因变异。（3）蛋白质免疫印迹法：）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩检测因基因突变而缩短了的短了的APC蛋白。蛋白。2结肠癌基因诊断方法结肠癌基因诊断方法77基因诊断与基因治疗培训教程第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目 录录78基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列
44、，其重复次数连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。在人群中存在变异，形成多态性。n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。n重复单位重复单位625 bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。重复单位重复单位26 bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNA。一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与多态性遗传标记79基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列(VNTR)人类染色体上小卫星人类染色体上小卫星DNA的高度可变区的高度可变区（HVR）是由头尾相连的串
45、联重复序列）是由头尾相连的串联重复序列（tandem repeat，TR）组成，）组成，TR的核心序列的核心序列同源性很高，等位同源性很高，等位HVR的长度由于的长度由于TR的重复的重复次数不同而有很大的差别，具高度多态性。次数不同而有很大的差别，具高度多态性。80基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 DNA长度多态除可用长度多态除可用Southern印迹杂交法印迹杂交法检测外，还可以通过检测外，还可以通过PCR扩增后电泳来检出。扩增后电泳来检出。扩增片段长度多态扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）81基因诊
46、断与基因治疗培训教程 1985年，英国遗传学家年，英国遗传学家Jeffeys等人用等人用TR的核心的核心序列为探针进行序列为探针进行RFLP分析时，检测到许多分析时，检测到许多HVR，并产生相应的图，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为度专一性，所以称其为DNA指纹图谱（指纹图谱（DNA fingerprinting）。）。Alec John JeffreysOxford,United Kingdom 目目 录录82基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录人类人类DNAD
47、NA指纹图指纹图83基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个体识别和亲子鉴定：个体识别和亲子鉴定：DNA指纹技术是从指纹技术是从基因水平检测基因水平检测DNA的高度多态性，个体识的高度多态性，个体识别率高。别率高。n以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型，分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。一认证。84基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录法医案检中的基因诊断技术法医案检中的
48、基因诊断技术nVNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）的小卫星）的核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析nSTR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）的微卫星）的PCR分分析析nSNP的基因芯片检测的基因芯片检测85基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录1单位点探针检测及单位点探针检测及PI值的计算值的计算 父权指数（父权指数（Paternity Index，PI）值、父）值、父权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一致。致。PI值表示争议父作为亲父比随机男人作为值表示争议父作为亲父比随机男人作为亲父的可能性大多少倍，亲父的可
49、能性大多少倍，PI值大于值大于1表示倾向表示倾向肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于0时表示排除父子关系时表示排除父子关系。86基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 2DNA指纹图与亲权鉴定指纹图与亲权鉴定 多位点多位点VNTR系统和系统和DNA指纹图的电指纹图的电泳分离后片段数目较多，各等位基因频率泳分离后片段数目较多，各等位基因频率分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识别时匹配概率的计算影响因素较多，目前别时匹配概率的计算影响因素较多，目前尚无一个公认的最合理的计算方法。尚无一个公认的最合理的计算方法。
50、目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在孩子孩子DNA指纹图中找出非母片段并计数为指纹图中找出非母片段并计数为P，然后分析争议父然后分析争议父DNA指纹图，看指纹图，看P条非母带条非母带在争议父中出现多少条。在争议父中出现多少条。87基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。88基因诊断与基因治疗培训教程第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy o
