1、兽医疫病监测诊断技术兽医疫病监测诊断技术提纲提纲疫病面临的复杂形势疫病面临的复杂形势常用实验室检测技术常用实验室检测技术动物疫病诊断技术现状动物疫病诊断技术现状 及应用及应用 检测技术发展方向与未来展望检测技术发展方向与未来展望 1 1疫病面临的复杂形势疫病面临的复杂形势 禽病种类多禽病种类多 农业部农业部一、二、三类动物疫病病种名录一、二、三类动物疫病病种名录中列入中列入157157种；种；其中一类禽病其中一类禽病2 2种（高致病性禽流感、新城疫）；二类禽种（高致病性禽流感、新城疫）；二类禽病病1818种（鸡传染性喉气管炎、鸡传染性支气管炎、传染性种（鸡传染性喉气管炎、鸡传染性支气管炎、传染
2、性法氏囊病、马立克氏病、产蛋下降综合征、禽白血病、禽法氏囊病、马立克氏病、产蛋下降综合征、禽白血病、禽痘、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭浆膜炎、小鹅瘟、禽霍乱、痘、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭浆膜炎、小鹅瘟、禽霍乱、鸡白痢、禽伤寒、鸡败血支原体感染、鸡球虫病、低致病鸡白痢、禽伤寒、鸡败血支原体感染、鸡球虫病、低致病性禽流感、禽网状内皮组织增殖症性禽流感、禽网状内皮组织增殖症）；三类禽病；三类禽病4 4种（鸡种（鸡病毒性关节炎、禽传染性脑脊髓炎、传染性鼻炎、禽结核病毒性关节炎、禽传染性脑脊髓炎、传染性鼻炎、禽结核病病）。4 4病毒病原毒株多、变异快病毒病原毒株多、变异快口蹄疫：口蹄疫：7个型，多个亚型；我国O
3、型、亚洲I型、A型禽流感：禽流感：A、B、C3个型；其中B、C两型仅能对人致 病，A型可对人、猪、马和禽致病。A型：H1H16亚型；H5H5亚型亚型：变异株不断出现新城疫：新城疫：病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）、强毒力型（即速发型）3型 PRRSPRRS：1996年美洲型；2006年变异株；2009年欧洲型1株。20122012年列入国家监测计划的动物疫病年列入国家监测计划的动物疫病（1616种）种）n高致病性禽流感高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟n鸡新城疫鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病n牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、
4、非洲猪瘟、蓝舌病 国家强制免疫 动物疫病 外来动物疫病6 6主要疫病的国家指定监测方法主要疫病的国家指定监测方法病病 名名指定诊断方法指定诊断方法高致病性禽流感高致病性禽流感血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）鸡新城疫鸡新城疫血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）传染性法氏囊病传染性法氏囊病血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）、）、ELISA传染性支气管炎传染性支气管炎血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）口蹄疫口蹄疫正向间接血凝试验、液相阻断正向间接血凝试验、液相阻断ELISA VP1-ELISA猪瘟猪瘟正向间接血凝试验、阻断正向间接血凝试验、阻断ELISA高致病性猪蓝耳病高致病性猪蓝耳病ELISA疫苗
5、种类各异、诊断试剂和方法多样疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样以禽流感为例以禽流感为例 血清学诊断技术血清学诊断技术 分子诊断技术分子诊断技术 血凝与血凝抑制试验血凝与血凝抑制试验神经氨酸酶抑制试验神经氨酸酶抑制试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验免疫荧光技术免疫荧光技术中和试验中和试验琼脂扩散试验琼脂扩散试验RT-PCR RT-PCR 和和Realtime RT-PCRRealtime RT-PCR荧光荧光RT-PCRRT-PCR、RT-PCR-ELISART-PCR-ELISA依赖核酸序列的扩增技术依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)(NASBA)环介导的等温扩增技术环介导的等温扩增技术(L
6、AMP)(LAMP)基因芯片技术基因芯片技术8 82 2常用实验室检测技术常用实验室检测技术常用实验室检测技术常用实验室检测技术组织病理学检测技术组织病理学检测技术血清学检测技术血清学检测技术分子生物学检测技术分子生物学检测技术病原学检测技术病原学检测技术诊断新技术诊断新技术组织病理学检测技术组织病理学检测技术1 1.病理学检测技术病理学检测技术 是利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和是利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变化对动物疫病进行诊断。病理变化对动物疫病进行诊断。2.2.免疫病理学检测技术免疫病理学检测技术(免疫组织化学技术免疫组织化学技术)免疫组织化学方法不仅可在脏器组
7、织中特异地检免疫组织化学方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原出病原,又可发挥病理学检测所具有直观、抗原定位又可发挥病理学检测所具有直观、抗原定位准确的特点准确的特点,还可在脏器组织原位检测出病原（原位还可在脏器组织原位检测出病原（原位PCRPCR）的同时，观察到组织病变与该病原的关系，从）的同时，观察到组织病变与该病原的关系，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。血清学检测技术血清学检测技术按其反应性质的不同可分为：按其反应性质的不同可分为：凝集性反应凝集性反应(如凝集试验和沉淀试验如凝集试验和沉淀试验)标记抗体技术标记抗体技术(包括荧光抗体、酶标抗体、放
8、射性标记抗体等包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体等 特点：特点：敏感、快速（敏感、快速（ELISA ELISA 只需要只需要1212小时）。小时）。补体参与的反应补体参与的反应(补体结合试验、免疫粘附血凝试验等补体结合试验、免疫粘附血凝试验等)。中和试验中和试验(病毒中和试验和毒素中和试验病毒中和试验和毒素中和试验)特点：特点：时间长，约需要时间长，约需要1818小时才能获得结果。小时才能获得结果。正向间接血凝诊断技术正向间接血凝诊断技术特点：特点：正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏
9、感、特异性。其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏感、特异性。操作要点及注意事项：操作要点及注意事项：A.A.试验准备：试验准备：制备制备1%1%红细胞悬液；选用孔底应光洁透明无可见红细胞悬液；选用孔底应光洁透明无可见 附着物的反应板附着物的反应板(一次性的最好一次性的最好)；待检血清要新鲜，未腐败、溶血，；待检血清要新鲜，未腐败、溶血，无悬浮物。无悬浮物。B.B.操作过程：操作过程：尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液
10、体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。C.C.结果判定：结果判定：正确判断正确判断50%50%凝集反应凝集反应待检样品待检样品2待检样品待检样品1阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照凝集和凝集抑制反应原理示意图凝集和凝集抑制反应原理示意图酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、安全、适合大批量标准化检测的特点。安全、适合大批量标准化检测的特点。是当前应用最广、发展最快的一项新技术，目前该是当前应用最广、发展最快的一项新技
11、术，目前该方法已被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。方法已被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。其基本过程是将抗原其基本过程是将抗原(或抗体或抗体)吸附于固相载体，在吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用酶标仪判定载体上进行免疫酶反应，底物显色后用酶标仪判定结果。结果。间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体双抗夹心法（双抗夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已
12、知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原竞争法（竞争法（Competitive ELISA)Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体ELISAELISA类型类型酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（以间接性（以间接性ELISAELISA为例）为例）：间接间接ELISA检测抗体检测抗体双抗原（体）夹心法测抗体（原）双抗原（体）夹心法测抗体（原）包被抗原包被抗原酶标抗原酶标抗原待测抗体待测抗体包被抗体包被抗体酶标抗体酶
13、标抗体待测抗原待测抗原双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗体夹心法检测抗原流程图双抗体夹心法检测抗原流程图竞争竞争ELISA检测抗体示意图检测抗体示意图分子生物学检测技术分子生物学检测技术用于动物疫病特异性病原基因、病原基因变异与进用于动物疫病特异性病原基因、病原基因变异与进化分析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，化分析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，为疫病防治提供基因理论分析依据。为疫病防治提供基因理论分析依据。核酸探针技术、基因序列分析核酸探针技术、基因序列分析 比如基因芯片试剂盒等。比如基因芯片试剂盒等。聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）（应用最广）
14、（应用最广）1 1、疫病的早期诊断和不完整病原的检测、疫病的早期诊断和不完整病原的检测2 2、快速、准确、安全的检测病原体、快速、准确、安全的检测病原体3 3、在病原体分类和鉴别中的应用、在病原体分类和鉴别中的应用PCR仪仪基因芯片仪基因芯片仪聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR)PCR)是以是以DNADNA高温变性、低温退火（复性）及适高温变性、低温退火（复性）及适温延伸温延伸为原理设计的。通过为原理设计的。通过PCRPCR技术获取病原微技术获取病原微生物的特异生物的特异DNADNA片段，从而为疾病诊断提供重要片段，从而为疾病诊断提供重要依据。依据。特点：特点：特异性强、灵敏度高、操作简便
15、、省时特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。等特点。2323反转录反转录PCRPCR技术技术即即RT-PCRRT-PCR技术。用于检测技术。用于检测RNARNA病病毒。毒。首先提取总首先提取总RNARNA，然后加入引物，然后加入引物在反转录酶的作用下合成在反转录酶的作用下合成cDNAcDNA，加热，加热变性成为单链变性成为单链cDNAcDNA后，加入与之互补后，加入与之互补的另一对引物，进行的另一对引物，进行PCRPCR反应。反应。分为一步法和两步法两种分为一步法和两步法两种RTRT-PCR反应原理图反应原理图多重多重PCRPCR技术技术(MULTI-PCR(MULTI-PCR）它是一种特
16、殊的它是一种特殊的PCRPCR形式，其最突出的特形式，其最突出的特点是一次点是一次PCRPCR反应在同一反应体系中同时反应在同一反应体系中同时加入多对不同加入多对不同PCRPCR引物和相应的模板，可同引物和相应的模板，可同时检测、鉴别出多种病原体，时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值用价值。病原学检测技术病原学检测技术1.1.细菌的分离与鉴定细菌的分离与鉴定2.2.病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定 是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病毒进行分类
17、鉴定的重要方法之一。但是对实验室能力要求毒进行分类鉴定的重要方法之一。但是对实验室能力要求较高，且耗时长。较高，且耗时长。3.3.寄生虫检测寄生虫检测 寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种:虫虫卵检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查卵检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查法。法。诊断新技术诊断新技术我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的快速快速诊断技术诊断技术以及能以及能区
18、分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断技术技术。目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下4 4种种:1.1.免疫胶体金快速诊断试纸条免疫胶体金快速诊断试纸条 2.2.荧光荧光PCRPCR 3.3.鉴别诊断技术鉴别诊断技术 4.4.原位原位PCRPCR技术技术免疫胶体金快速诊断试纸条免疫胶体金快速诊断试纸条p胶体金技术（胶体金技术（ImmunogoldImmunogold labeling technique labeling technique）是以胶是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免体金作为示踪标
19、记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。疫标记技术。p简捷快速：操作简单，一般只要简捷快速：操作简单，一般只要5 5-10min-10min 就会出结果，就会出结果，而其它方法如而其它方法如ELISAELISA需要需要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。p结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。p特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。了它具有很好的特异性。p胶体金胶体金（Colloidal goldColloidal go
20、ld）是氯金酸（是氯金酸（HAuClHAuCl4 4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。的胶体状态。2929胶体金试纸条示意图胶体金试纸条示意图检测线检测线质检线质检线吸收垫吸收垫样品垫样品垫硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜连接垫连接垫（胶体金垫）（胶体金垫）背衬背衬（底板）（底板）3030实时荧光定量实时荧光定量PCR 与普通与普通PCR相比：相比：1.自动化程度高，极短的检测时间（没自动化程度高，极短的检测时间（没有了制胶和有了制胶和PCR产物电泳步骤，
21、快速热产物电泳步骤，快速热循环仪也缩减了运行时间，在循环仪也缩减了运行时间，在30分钟内分钟内可以得到完美的实验结果可以得到完美的实验结果）；）；2.敏感性为普通敏感性为普通PCR的的100倍；倍；3.直观的软件分析；直观的软件分析；4.有效解决有效解决PCR污染问题；污染问题；5.安全性更好。安全性更好。6.不足：资金投入大，不足：资金投入大，检测成本高。检测成本高。实时荧光定量PCR反应软件分析截图实时荧光定量PCR仪3131CtCt值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。指数增长阶段的阈值所对
22、应的循环次数。3232确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光达荧光达到某一值（域值）时所需到某一值（域值）时所需要的循环数越少要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量样品中所含的模板量3333鉴别诊断技术鉴别诊断技术鉴别诊断技术的重要性：鉴别诊断技术的重要性：A A：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术；：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术；B B：从普遍免疫的动物群体中甄别出自然感染和带毒的动：从普遍免疫的
23、动物群体中甄别出自然感染和带毒的动物。物。该项技术的核心是基因工程技术、该项技术的核心是基因工程技术、单克隆抗体技术单克隆抗体技术与诊断与诊断技术的综合运用，其科技水平高，难度较大。技术的综合运用，其科技水平高，难度较大。单克隆抗体技术单克隆抗体技术 目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的ELISAELISA试剂试剂盒盒 （比如猪瘟）。（比如猪瘟）。原位原位PCRPCR分子病理学新技术分子病理学新技术是一种将是一种将PCRPCR技术与原位杂交技术结合起来的可以技术与原位杂交技术结合起来的可以检测组织细胞中微量检测组织细胞中微量DNADNA或或RNARNA且
24、可精确定位的新且可精确定位的新技术。技术。特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组织目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组织中寄生虫感染的报道。中寄生虫感染的报道。3 3检测技术发展方向与未来展望检测技术发展方向与未来展望血清学检测技术发展方向血清学检测技术发展方向u简单、快速便于普及的快速诊断技术简单、快速便于普及的快速诊断技术 以胶体金标记技术为代表，操作简单、快捷，实现现地现用。u高度集成、自动化的仪器诊断技术高度集成、自动化的仪器诊断技术 以ELISA（全自动酶免工作站）为代表，可实现大规模操作，且灵敏度高、
25、特异性强。分子检测技术的发展方向分子检测技术的发展方向1 1、自动化、自动化 利用全自动仪器完成核酸提取、反应液配制、上机反应和结果分析的所有步骤多功能新型生物液体处理工作站：可以一机实现DNA/RNA提取和PCR反应建立 实时荧光定量PCR仪：可以一机实现上机反应和结果分析2 2、高通量、高通量 在提高灵敏度和特异性的基础上，实现一次检测分析所有常见疫病和对一种疫病分型的目的。3 3、检测与核酸序列分析的综合、检测与核酸序列分析的综合 随着测序仪器设备的完善，将检测与序列分析结合的诊断技术将逐步应用于临床。分子检测技术的发展方向分子检测技术的发展方向结束语结束语 正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保护人民身体健康。护人民身体健康。谢谢 谢谢 ！4141
