1、第三章第三章 可移动的遗传因子（转座子）可移动的遗传因子（转座子）和染色体外遗传因子和染色体外遗传因子 生化教研室生化教研室 肖建英肖建英主要内容主要内容第一节第一节 转转 座座 子子第二节第二节 质质 粒粒第三节第三节 遗传重组遗传重组第一节第一节 转转 座座 子子l 转座子转座子(transposons)概念：概念：在原核生物与真核生物基因组中存在在原核生物与真核生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点着可从一个染色体位点转移到另一位点的一些的一些DNA序列。序列。转座子是基因组突变的主要因素之一。转座子是基因组突变的主要因素之一。一、转座子的分类和结构特征一、转座子的分类和结构
2、特征（一）原核生物转座子的类型：（一）原核生物转座子的类型：1、插入序列、插入序列（insertion sequences，IS）最简单的转座子。最简单的转座子。二个分离的反向末端重复序列二个分离的反向末端重复序列 (inverted terminal repeats,ITR)一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR2、复合转座子复合转座子 类转座子类转座子 由由IS类转座组件构成的复合体。类转座组件构成的复合体。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因组成：组成：两端为两端为IS 中间编码抗生素物质中间编码抗生
3、素物质3、复杂转座子、复杂转座子类转座子（类转座子（Tn A家族）家族）携带转座和耐药等基因的独立体家族。携带转座和耐药等基因的独立体家族。组成：两端为组成：两端为ITR，而不是，而不是IS 中间编码区含中间编码区含转座酶编码基因，及转座酶编码基因，及 抗生素抗性和解离酶等编码基因。抗生素抗性和解离酶等编码基因。4、转座噬菌体、转座噬菌体类转座子类转座子（二）真核生物转座子的类型：（二）真核生物转座子的类型：1、酵母菌中的转座子、酵母菌中的转座子Ty因子：因子：2、果蝇中的转座子、果蝇中的转座子P因子、因子、FB因子等：因子等：3、玉米中转座子、玉米中转座子玉米调控元件玉米调控元件4、逆转录转
4、座子、逆转录转座子逆转录病毒、病毒超家族逆转录病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。及非病毒超家族。l 转座子的共同特点：转座子的共同特点：两端有反向重复序列两端有反向重复序列 转座后靶位点是正向重复转座后靶位点是正向重复 编码与转座有关的蛋白编码与转座有关的蛋白转座酶转座酶 可以在基因组中移动可以在基因组中移动l 转座机制：转座机制：复制型转座复制型转座非复制型转座非复制型转座保守型转座保守型转座二、转座子机制二、转座子机制（一）转座中复制子融合形成共和体（一）转座中复制子融合形成共和体(cointegrate)一个含有两个质粒的细胞，质粒各有一个转座一个含有两个质粒的细胞，质粒各有一个转座子，
5、两个质粒可以融合在一起形成共和体，这一子，两个质粒可以融合在一起形成共和体，这一过程称过程称复制子融合（复制子融合（replicon fusion）。）。AB共和体共和体（二）转座子的复制过程（二）转座子的复制过程经几个世代经几个世代（三）转座作用模型（三）转座作用模型对称对称模型模型（四）转座作用模型（四）转座作用模型非对称非对称模型模型 三、转座效应三、转座效应1、转座的遗传效应：、转座的遗传效应：转座最典型的作用是引起不稳定的突变等位基因。转座最典型的作用是引起不稳定的突变等位基因。l 转座子导致突变，插入致基因失活是转座最转座子导致突变，插入致基因失活是转座最直接的效应。直接的效应。l
6、 转座也可干扰宿主基因与调控元件之间的关系，转座也可干扰宿主基因与调控元件之间的关系，或改变或改变DNA结构而影响基因表达。结构而影响基因表达。2、精确转座的结构效应：、精确转座的结构效应：转座事件可介导两侧的宿主转座事件可介导两侧的宿主DNA发生一系列发生一系列的基因重排。的基因重排。3、异常转座的效应：、异常转座的效应：异常转座包括：一端转座；异常转座包括：一端转座；部分转座部分转座 隐藏位点转座隐藏位点转座 协同转座协同转座 倒位转座倒位转座4、对宿主细胞活力的影响：、对宿主细胞活力的影响：影响细胞影响细胞DNA代谢，介导基因异常重排。代谢，介导基因异常重排。三种形式：三种形式：修复切割
7、所留下的切口修复切割所留下的切口 转座子内部的重排转座子内部的重排 转座子间的重排转座子间的重排5、转座子作为研究工具：、转座子作为研究工具：主要用于如下研究：主要用于如下研究：基因传送载体基因传送载体 结构重组结构重组 基因表达基因表达 基因突变基因突变 克隆克隆 基因作图基因作图四、原核生物和真核生物的转座子四、原核生物和真核生物的转座子（一）原核生物的转座子（一）原核生物的转座子1、插入序列（、插入序列（IS）与）与类复合转座子类复合转座子 二个分离的反向重复序列（二个分离的反向重复序列（ITR）一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 l 插入序列是最简单的转座
8、子。包括：插入序列是最简单的转座子。包括：l 类复合转座子由耐药性基因和两个相同的类复合转座子由耐药性基因和两个相同的IS组成。组成。ISIS抗生素抗性基因抗生素抗性基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因2、转座子、转座子A家族（家族（Tn A）类复杂转座子类复杂转座子组成：组成：长约长约5kb，两端为，两端为ITR，而不是，而不是IS 中间编码区含中间编码区含转座酶编码基因，及转座酶编码基因，及 抗生素抗性和解离酶等编码基因。抗生素抗性和解离酶等编码基因。u 不是不是IS类转座组件的复合体，而是携带转座类转座组件的复合体，而是携带转座和耐药等基因的独立体。和耐药等基因的
9、独立体。Tn A家族是由许多相关的转座子组成的。如：家族是由许多相关的转座子组成的。如：Tn 3、Tn 1、Tn 501等。等。3、转座噬菌体、转座噬菌体l 转座噬菌体是一种溶菌周期和溶源性交替转座噬菌体是一种溶菌周期和溶源性交替 方式的噬菌体，可诱发大肠杆菌突变。方式的噬菌体，可诱发大肠杆菌突变。u Mu噬菌体：噬菌体：既有温和噬菌体的特性，又有转座子的特性。既有温和噬菌体的特性，又有转座子的特性。噬菌体噬菌体DNA的多个拷贝转座到染色体的多个拷贝转座到染色体DNA的许的许多位点上，最终由这些染色体上的转座单位进行多位点上，最终由这些染色体上的转座单位进行噬菌体包装。噬菌体包装。Mu噬菌体基
10、因组右末端，存在由噬菌体基因组右末端，存在由3kb组成的组成的G片片段，或称可倒位片段。段，或称可倒位片段。G片段在不同的片段在不同的Mu噬菌噬菌体体DNA分子中取向不同。分子中取向不同。G片段携带两种不同基因：片段携带两种不同基因：G（）取向时，基因（）取向时，基因 S 和和 U 表达；表达；G（）取向时，基因（）取向时，基因 S和和 U表达。表达。图图 G片段片段 p68（二）真核生物的转座子（二）真核生物的转座子1、酵母菌中的转座子、酵母菌中的转座子Ty因子：因子：Ty因子是一大类转座子，长因子是一大类转座子，长6.3kb，两端各有一段，两端各有一段长长334bp的顺向重复序列，称为的顺
11、向重复序列，称为成分。成分。每个酵母细胞基因组大约有每个酵母细胞基因组大约有3035拷贝的拷贝的Ty因子，因子，有约有约100个独立存在的个独立存在的成分。成分。2、还原病毒与转座子：、还原病毒与转座子：还原病毒为单链还原病毒为单链RNA病毒，基因组病毒，基因组RNA长长710kb，有，有gag、pol、env三种基因。三种基因。还原病毒与转座子有相似性，可能由祖先转座子还原病毒与转座子有相似性，可能由祖先转座子衍生而来。衍生而来。3、非病毒返座子：、非病毒返座子：u 遗传信息的移动是从遗传信息的移动是从DNA到到DNA，这种转移过程称为这种转移过程称为转座（转座（transposition）
12、；）；被转移的遗传信息单元称为被转移的遗传信息单元称为转座子（转座子（transposon）u 遗传信息的移动是从遗传信息的移动是从DNA到到RNA再到再到DNA，这种这种RNA介导的转座作用称为介导的转座作用称为返座作用返座作用；被转移的遗传信息单元称为被转移的遗传信息单元称为返座子返座子。u 真核生物的非病毒返座子都起源于真核生物的非病毒返座子都起源于RNA pol和和的转录产物。的转录产物。前者为长散布重复序列，后者为短散布重复序列。前者为长散布重复序列，后者为短散布重复序列。4、玉米调控元件：、玉米调控元件：是真核生物中首先被发现的转座子。是真核生物中首先被发现的转座子。玉米调控元件有
13、几个家族，玉米调控元件有几个家族，每个家族分为两大类：每个家族分为两大类：一类是自发元件，另一类是非自发元件。一类是自发元件，另一类是非自发元件。五、逆转录病毒和逆转录转座子五、逆转录病毒和逆转录转座子 以以RNA介导的转座与逆转录病毒有关，被转移介导的转座与逆转录病毒有关，被转移的因子称为的因子称为逆转录转座子逆转录转座子。逆转录转座子是真核生物转座子的重要类型。逆转录转座子是真核生物转座子的重要类型。n 逆转录病毒与逆转录转座子的区别：逆转录病毒与逆转录转座子的区别：逆转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以逆转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以在细胞之间转移。在细胞之间转移。逆转录转座子
14、是宿主逆转录转座子是宿主DNA基因组的组分，可以基因组的组分，可以在基因组内转座，但不能在细胞之间转移。在基因组内转座，但不能在细胞之间转移。1、逆转录病毒基因组与逆转录转座子结构、逆转录病毒基因组与逆转录转座子结构（1）逆转录病毒：）逆转录病毒：两条正链两条正链RNA（二倍体）（二倍体）34个基因，由个基因，由gag、pol、env组成。组成。存在两种存在两种mRNA，一种为长的，一种为长的mRNA翻译翻译gag和和pol两种蛋白。两种蛋白。（2）逆转录转座子：）逆转录转座子：与逆转录病毒结构有许多相似之处，包括：与逆转录病毒结构有许多相似之处，包括：同向长末端重复序列、每个重复序列两侧是短
15、同向长末端重复序列、每个重复序列两侧是短反向重复序列、中央区域含反向重复序列、中央区域含gag和和pol的阅读框架。的阅读框架。但但env基因被破坏或没有，故逆转录转座子不能基因被破坏或没有，故逆转录转座子不能形成感染粒子。二者的活性机制是不同的。形成感染粒子。二者的活性机制是不同的。2、逆转录病毒与转座、逆转录病毒与转座u 逆转录产生的线形病毒逆转录产生的线形病毒DNA，由整合酶催化，由整合酶催化 插入宿主靶位点插入宿主靶位点DNA，这一整合过程与转座，这一整合过程与转座 子一样。子一样。病毒病毒DNA的末端相当重要，如发生突变的末端相当重要，如发生突变 则抑制整合。则抑制整合。u 逆转录病
16、毒感染细胞主要产生两种结果：逆转录病毒感染细胞主要产生两种结果：逆转录产生原病毒像溶源性噬菌体逆转录产生原病毒像溶源性噬菌体DNA一样，一样，成为宿主基因组的一部分；成为宿主基因组的一部分；细胞细胞DNA序列可能与病毒序列重组，并经过序列可能与病毒序列重组，并经过转座作用插入新位点，改变细胞的性质。转座作用插入新位点，改变细胞的性质。3、逆转录病毒与转导、逆转录病毒与转导u 逆转录病毒可转导真核细胞的序列，常被称逆转录病毒可转导真核细胞的序列，常被称为为转导逆转录病毒转导逆转录病毒。u 原病毒原病毒DNA整合在整合在C-onc基因附近，二者可基因附近，二者可融合在一起，转录后形成一条即含病毒序
17、列又含融合在一起，转录后形成一条即含病毒序列又含C-onc的的RNA，后者如含包装信号可被包装进，后者如含包装信号可被包装进病毒颗粒中，形成含有一条融合病毒颗粒中，形成含有一条融合RNA和一条正和一条正常病毒常病毒RNA的二倍体病毒颗粒。的二倍体病毒颗粒。二者分子之间发生重组将会产生二者分子之间发生重组将会产生转化逆转录转化逆转录病毒基因组。病毒基因组。病毒携带病毒携带V-onc，即具有转化能力。，即具有转化能力。第二节第二节 质质 粒粒 质粒（质粒（plasmid）：）：为多数细菌和某些真核细胞染色体外的环状双为多数细菌和某些真核细胞染色体外的环状双链链DNA分子分子。特点：特点：能在宿主细
18、胞内独立复制，带有某些遗传信能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。但质粒并不是它的宿主细胞所必需的。但质粒并不是它的宿主细胞所必需的。一、质粒的遗传学类型一、质粒的遗传学类型1、F 质粒：质粒：为性质粒，是一个小的超螺旋闭环为性质粒，是一个小的超螺旋闭环DNA（约（约95kb）。）。可将宿主染色体基因转移至另一宿主基因可将宿主染色体基因转移至另一宿主基因组中，其本身转移到缺乏组中，其本身转移到缺乏F 质粒的细胞。质粒的细胞。2、R 质粒：质粒：为耐药性质粒，由抗性转移因子为耐药性质粒，由抗性转移因子DNA和决定抗性因子和决定抗性因
19、子DNA两部分组成。两部分组成。后者含有对抗生素的抗性基因，使宿主细后者含有对抗生素的抗性基因，使宿主细菌产生对抗生素的抗性。菌产生对抗生素的抗性。3、col 质粒：质粒：含有合成大肠杆菌素基因的质粒，含有合成大肠杆菌素基因的质粒，能杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌。能杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌。4、质粒噬菌体（噬粒，、质粒噬菌体（噬粒，phagemid）：）：能把完整的质粒引入某种噬菌体能把完整的质粒引入某种噬菌体DNA成为成为一种嵌合体。一种嵌合体。嵌合体嵌合体DNA的遗传学行为取决于某一复制子的遗传学行为取决于某一复制子的强弱。的强弱。表现噬菌体行为表现噬菌体行为称称质粒噬菌体质粒噬菌体；
20、表现质粒的行为表现质粒的行为称称噬菌体质粒噬菌体质粒。二、质粒二、质粒DNA的特性的特性（一）质粒的复制（一）质粒的复制 依赖细菌染色体的多种酶系统。依赖细菌染色体的多种酶系统。1 1、严紧型质粒的复制：、严紧型质粒的复制：u 只在细胞周期的一定阶段进行复制，与细菌只在细胞周期的一定阶段进行复制，与细菌 的繁殖密切相关。的繁殖密切相关。u 需要蛋白质合成和需要蛋白质合成和 DNA DNA polpol 的存在的存在。u 每个细胞只有每个细胞只有 1 15个拷贝。个拷贝。2 2、松弛型质粒的复制：、松弛型质粒的复制：u 在整个细胞周期中随时都可进行复制。在整个细胞周期中随时都可进行复制。u 需用
21、需用DNA DNA polpol的存在。的存在。u 在细胞内有在细胞内有1010200200个以个以上上,甚至多达数千个。甚至多达数千个。质粒复制方式：质粒复制方式：均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。质粒复制形式多样，包括：质粒复制形式多样，包括：单向复制、双向复制、单向与双向并存。单向复制、双向复制、单向与双向并存。（二）质粒的不相容性（二）质粒的不相容性l 质粒的不相容性是指细菌质粒不能在相同质粒的不相容性是指细菌质粒不能在相同 细胞中同时存在的现象。细胞中同时存在的现象。l 当某种质粒在宿主细胞内存在时，会阻止当某种质粒在宿主细胞内存
22、在时，会阻止 其它质粒进入细胞寄宿，这种质粒称为其它质粒进入细胞寄宿，这种质粒称为 不相容质粒。不相容质粒。（三）质粒的转移性（三）质粒的转移性l 通过细菌的结合作用，通过细菌的结合作用，F 质粒在不丢失本质粒在不丢失本 身的情况下，可从一个细胞转移到无身的情况下，可从一个细胞转移到无F 质质 粒的另一个细胞中。粒的另一个细胞中。图图 质粒转移过程质粒转移过程 p75（四）质粒中的选择性标记（四）质粒中的选择性标记常用的选择性标记是抗生素抗性基因，包括：常用的选择性标记是抗生素抗性基因，包括：1、氨苄青霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因 2、四环素抗性基因、四环素抗性基因 3、氯霉素抗性基因、氯
23、霉素抗性基因cmr 或或 cat常用的质粒载体含有一个或两个抗生素抗性基因。常用的质粒载体含有一个或两个抗生素抗性基因。三、特殊细菌质粒三、特殊细菌质粒（一）（一）F 质粒质粒 性质粒性质粒 F 质粒是一种环状的质粒是一种环状的DNA分子，分子量分子，分子量94.5kb；F 质粒有整合进入细胞染色体而产生质粒有整合进入细胞染色体而产生Hfr细胞细胞 的能力；的能力；染色体上有染色体上有20多个整合位点，多个整合位点，F质粒对其亲和力质粒对其亲和力 不同，形成不同，形成Hfr 细胞株的频率也是不同的；细胞株的频率也是不同的；F 质粒的整合方向可以是顺时针，也可逆时针；质粒的整合方向可以是顺时针，
24、也可逆时针；F 质粒可从一个细胞转移到另一无质粒可从一个细胞转移到另一无F 质粒的细胞。质粒的细胞。（二）（二）R 质粒质粒耐药性质粒耐药性质粒 R 质粒由抗性转移因子（质粒由抗性转移因子（RTF）和决定抗性）和决定抗性 因子（因子（r-决定子）两部分决定子）两部分DNA片段组成。片段组成。R 质粒含有对抗生素的抗性基因，使宿主细质粒含有对抗生素的抗性基因，使宿主细 菌产生对抗生素的抗性，这种耐药性是可以菌产生对抗生素的抗性，这种耐药性是可以 遗传的。遗传的。（三）（三）Col 质粒质粒大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 是能产生大肠杆菌素的大肠杆菌质粒，可以是能产生大肠杆菌素的大肠杆菌质粒，可以 抑制
25、或杀死不含抑制或杀死不含Col 质粒的亲缘细菌。质粒的亲缘细菌。四、真核生物中的质粒四、真核生物中的质粒u 已发现在单细胞真核生物酵母中有质粒的存在。已发现在单细胞真核生物酵母中有质粒的存在。l 在高等生物细胞中，即使有质粒的存在，也在高等生物细胞中，即使有质粒的存在，也 远不如在细菌中那样普遍。远不如在细菌中那样普遍。l 在有性繁殖的高等生物细胞中，质粒在有性繁殖的高等生物细胞中，质粒DNA是是 不能进行转移的。不能进行转移的。杀伤微粒是一个双链杀伤微粒是一个双链RNA分子，这是唯一分子，这是唯一 没有没有DNA的质粒。的质粒。酵母中存在酵母中存在2m质粒，位于细胞核。拷贝数质粒，位于细胞核
26、。拷贝数 高，每个细胞周期每个高，每个细胞周期每个DNA分子只复制一次。分子只复制一次。基因工程质粒载体的特点基因工程质粒载体的特点第三节第三节 遗传重组遗传重组u 遗传重组的概念：遗传重组的概念：在减数分裂时，通过同源染色体的交换和非在减数分裂时，通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。（genetic recombination）广义的遗传重组：广义的遗传重组：指任何产生新的基因组合，指任何产生新的基因组合，从而造成基因型变化的过程，包括独立分配从
27、而造成基因型变化的过程，包括独立分配 或基因交换。或基因交换。狭义的遗传重组狭义的遗传重组：仅涉及：仅涉及DNA分子的断裂并重分子的断裂并重新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换。新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换。遗传重组的类型：遗传重组的类型：同源重组：同源重组：homologous recombination 位点特异性重组：位点特异性重组：site-specific recombination 转座重组转座重组:transposition recombination 异常重组异常重组:illegitimate recombination 一、同源重组一、同源重组 （homo
28、logous recombination）发生在发生在同源序列间同源序列间的重组称为的重组称为同源重组，同源重组，又又称称基本重组基本重组。是最基本的。是最基本的DNA重组方式。重组方式。通过链的断裂和再连接，在两个通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子分子大片同源序列间进行单链或双链片段的交换。大片同源序列间进行单链或双链片段的交换。1、同源重组的产生：、同源重组的产生：u 产生条件：产生条件：只要两条只要两条DNA序列相同或相似，序列相同或相似，就可以在序列的任何一点发生同源重组。就可以在序列的任何一点发生同源重组。2、同源重组的分子机制：、同源重组的分子机制：片段重组体片段重组体基本无重
29、组发生基本无重组发生：切开的链与原来断裂的是同一条链，切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体交换重组交换重组：切开的链并非原来断裂的链，重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。内切酶内切酶(RecBCD)DNA侵扰侵扰(RecA)分支迁移分支迁移 (RuvAB)内切酶内切酶(RecBCD)DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3
30、 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(RuvC)内切酶内切酶(RuvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体3、同源重组的酶学、同源重组的酶学对大肠杆菌的研究最为深入，主要蛋白质有：对大肠杆菌的研究最为深入，主要蛋白质有：（1）RecBCD的作用：的作用：
31、RecBCD是一个功能酶，是一个功能酶，含有三种亚基，具有三种酶活性：含有三种亚基，具有三种酶活性：核酸酶活性：核酸酶活性：依赖依赖ATP，在，在DNAchi位点右侧位点右侧 剪切产生剪切产生3游离末端。游离末端。解旋酶活性：解旋酶活性：需用需用ATP，从，从DNA一端将双链一端将双链 DNA解开。解开。ATPase活性：活性：水解水解ATP提供能量。提供能量。图图 RecBCD 作用机制作用机制 p83（2）Rec A 的作用：的作用：Rec A是重组中最重要的蛋白质，称是重组中最重要的蛋白质，称重组蛋白。重组蛋白。l Rec A功能：功能：在在ATP的协助下，的协助下，促进各种促进各种DN
32、A 分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的 联合分子。联合分子。（3）Ruv AB 的作用：的作用：由由A和和B两种亚基组成，两种亚基组成，二者结合在一起才是活性的形式。二者结合在一起才是活性的形式。l RuvAB最主要的功能最主要的功能：凭借其解旋酶活性，：凭借其解旋酶活性，推动推动Holliday中间体的分支迁移。中间体的分支迁移。（4）Ruv C 的作用：的作用：Ruv C 是一种内切酶，可特异识别是一种内切酶，可特异识别Holliday分支。分支。功能：功能：在重组中诱发在重组中诱发Holliday中间体的拆分作用。中间体的拆分作用。l 拆
33、分分三步进行：拆分分三步进行：第一：第一：Ruv C 结合于结合于Holliday中间体；中间体；第二：改变第二：改变DNA构象，需用构象，需用Mg2 或或Ca2；第三：切割，需用第三：切割，需用Mg2。4、同源重组的主要途径、同源重组的主要途径（1）Rec BCD 途径：是最重要的一条途径。途径：是最重要的一条途径。（2）Rec F 途径：在途径：在Rec BCD 途径不能运作途径不能运作 的情况下，大肠杆菌启动该途径。的情况下，大肠杆菌启动该途径。（3）Rec E 途径：不用途径：不用Rec BCD，也不用，也不用Rec A。（4）Red 途径：为重组缺陷途径，是途径：为重组缺陷途径，是噬
34、菌体噬菌体 专用途径。专用途径。二、位点特异性重组：二、位点特异性重组：（site-specific recombination）u 概念：概念：是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的序列的 特异位点间发生的整合。特异位点间发生的整合。位点特异性重组不依赖于位点特异性重组不依赖于DNA序列的同源性，而序列的同源性，而依赖于能与某些酶结合的特异依赖于能与某些酶结合的特异DNA序列的存在。序列的存在。u 位点特异性重组与同源重组的区别：位点特异性重组与同源重组的区别：同源重组中同源重组中DNA链的切断是完全随机的；链的切断是完全随机的；位点特异性重组位点特异性重组是在某些特异的是
35、在某些特异的DNA 序列处发生重组。序列处发生重组。同源重组后染色体内的同源重组后染色体内的DNA序列一般仍按序列一般仍按 原来的顺序排列；原来的顺序排列；位点特异性重组位点特异性重组中中DNA节段的相对位置节段的相对位置 发生了移动，即发生了移动，即DNA序列发生重排，从而得序列发生重排，从而得 到不同的结果。到不同的结果。（一）（一）噬菌体噬菌体DNA对对E.coli 的整合的整合1、噬菌体噬菌体DNA的整合作用：的整合作用：u 噬菌体感染大肠杆菌后，有两种生活方式：噬菌体感染大肠杆菌后，有两种生活方式：裂解生长途径（溶菌生长）：裂解生长途径（溶菌生长）：lysis pathway 溶源菌
36、生长途径：溶源菌生长途径：lysogenic pathwayl 噬菌体在噬菌体在溶源周期和裂解周期中，其溶源周期和裂解周期中，其DNA 状态不同，两种状态的相互转变（整合与切离）状态不同，两种状态的相互转变（整合与切离）是通过位点特异性重组实现的。是通过位点特异性重组实现的。这些特异位点叫附着点（这些特异位点叫附着点（attachment site），），简称为简称为 att。BOBatt Batt PPOPIntIHFIntXisIHFBOPPOBatt Latt R原原噬菌体噬菌体切除切除整合整合细菌细菌DNA噬菌体噬菌体u 噬菌体的整合作用有两个特点：噬菌体的整合作用有两个特点：DNA和
37、宿主和宿主DNA的交换是可逆的，的交换是可逆的，原先存在的原先存在的DNA序列全部被保存下来，并序列全部被保存下来，并无丢失。无丢失。噬菌体和细菌的噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。特定的核苷酸。2、噬菌体整合的分子机制：噬菌体整合的分子机制：u 分成三个阶段：分成三个阶段：整合酶与整合酶与DNA、宿主、宿主DNA的的 att 位点位点结合形成复合物；结合形成复合物；链交换，两条链形成链交换，两条链形成Holliday连接；连接；拆分拆分Holliday中间体，形成重组分子。中间体，形成重组
38、分子。u 噬菌体噬菌体整合需要两种蛋白：整合需要两种蛋白：整合酶（整合酶（integratase，Int）：）：噬菌体编码。噬菌体编码。有三种功能：有三种功能：噬菌体的插入；原噬菌体的噬菌体的插入；原噬菌体的 切离；拓扑异构酶活性。切离；拓扑异构酶活性。整合宿主因子（整合宿主因子（integration host factor，IHF）宿主宿主him A基因编码，对整合起促进作用。基因编码，对整合起促进作用。u 噬菌体的切除需要三种蛋白：噬菌体的切除需要三种蛋白：整合酶（整合酶（integratase，Int）：）：整合宿主因子（整合宿主因子（IHF）：）：切除酶（切除酶（excisionas
39、e，Xis）：）：Xis和和Int结合形结合形成复合物，作用于成复合物，作用于BOP和和POB位点，促进两者位点，促进两者之间的相互作用和重组。之间的相互作用和重组。u 整合与切离的反应如下：整合与切离的反应如下：POP(attP)+BOB(attB)Int,IHF,XisInt,IHFBOP(attL)+POB(attR)u 酶蛋白作用的特异性：酶蛋白作用的特异性：Int、IHF只能在只能在attP（POP）上形成整合）上形成整合体，再作用于体，再作用于attB（BOB），继而切断、相），继而切断、相互交换重组连接。互交换重组连接。Int、IHF不能在不能在attL（BOP）或或attR（P
40、OB）上形成整合体，从而决定重）上形成整合体，从而决定重组方向。组方向。Xis、Int、IHF只能与只能与attL（BOP）或）或attR（POB）上形成另一种整合体，重组结果是上形成另一种整合体，重组结果是 使原噬菌体从宿主基因组上切离下来。使原噬菌体从宿主基因组上切离下来。u 整合需识别整合需识别attP和和attB，切离需识别，切离需识别attL和和attR，所以，位点特异性重组是通过重组位点，所以，位点特异性重组是通过重组位点的鉴别来控制的。的鉴别来控制的。（二）免疫球蛋白（抗体）（二）免疫球蛋白（抗体）VDJ重排重排1、V（D）J 重排特点：重排特点：u 抗体结构：抗体结构：免疫球蛋
41、白免疫球蛋白(IgIg)，由两条轻链由两条轻链(L(L链链)和和两条重链两条重链(H(H链链)组成。组成。抗体与外来抗原的结合位置称可变区抗体与外来抗原的结合位置称可变区（variable regions），又称），又称V区区，V区与抗体区与抗体 识别有关，决定抗体识别的特异性。识别有关，决定抗体识别的特异性。抗体分子的其它部位称为恒定区（抗体分子的其它部位称为恒定区（constant region），又称），又称C区。同一种类抗体，区。同一种类抗体，C区不变。区不变。免疫球蛋白（免疫球蛋白（Ig）分别由三个独立的基因家）分别由三个独立的基因家族编码，其中两个编码轻链（族编码，其中两个编码轻链
42、（和和），一个编码），一个编码重链。重链。因基因家族中有因基因家族中有多种多种V、J、D基因片段基因片段，每条轻链只能随机选择每条轻链只能随机选择V、J各一重排，重链选各一重排，重链选V、D、J 各一重排，才能表达出抗体多肽链。各一重排，才能表达出抗体多肽链。这种这种Ig基因重排属于位点特异性基因重组。基因重排属于位点特异性基因重组。重链的基因片段：重链的基因片段：轻链的基因片段：轻链的基因片段：L V J C L V D J C u 抗体基因：抗体基因：重链重链(IgHIgH)基因的基因的V-D-JV-D-J重排和轻链重排和轻链(IgLIgL)基基因的因的V-JV-J重排均发生在特异位点上。
43、在重排均发生在特异位点上。在V V片段的下片段的下游，游，J J片段的上游以及片段的上游以及D D片段的两侧均存在保守的片段的两侧均存在保守的重组信号序列重组信号序列(recombination signal sequence,(recombination signal sequence,RSS)RSS)。排列规则总是排列规则总是12bp12bp序列与序列与23bp23bp序列连接序列连接，这种这种12/2312/23规则保证轻链与重链的正确连接。规则保证轻链与重链的正确连接。2、重组信号：、重组信号：CACAGTG （12/23）ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG 重组信
44、号序列重组信号序列 （RSS）53重组酶基因重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质共有两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。u 重组酶的作用：重组酶的作用：一种酶识别一种酶识别VDJ基因片段两侧的基因片段两侧的RSS序列；序列；另一种酶切断七聚体与基因片段，并连接另一种酶切断七聚体与基因片段，并连接DNA。3、重组酶（、重组酶（recombinase）Ig基因重排通过一组基因重排通过一组VDJ重组酶的作用。重组酶的作用。V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子
45、内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程4、V（D）J 重组机制：重组机制：三、遗传重组在分子生物学中的应用三、遗传重组在分子生物学中的应用1、转基因或基因敲除、转基因或基因敲除2、转基因技术应用于疾病治疗、转基因技术应用于疾病治疗u 转基因动物的应用：转基因动物的应用：建立转基因动物模型，研究疾病的发病机制；建立转基因动物模型，研究疾病的发病机制；生产药用蛋白；生产药用蛋白；生产可用于人体器官移植的动物器官；生产可用于人体器官移植的动物器官；提高家畜的产量；提高家畜的产量；研究基因的功能及表达调控。研究基因的功能及表达调控
46、。u 转基因植物转基因植物提高产量，抗病能力增强等提高产量，抗病能力增强等。3、基因打靶（、基因打靶（gene targeting）复习题复习题1、解释概念：、解释概念：转座子、逆转录转座子、质粒、转座子、逆转录转座子、质粒、遗传重组、同源重组、位点特异重组、基因打靶遗传重组、同源重组、位点特异重组、基因打靶2、简述原核生物转座子的类型及组成特点。、简述原核生物转座子的类型及组成特点。3、解释逆转录病毒与逆转录转座子的区别，并、解释逆转录病毒与逆转录转座子的区别，并 说明逆转录病毒是如何转导真核细胞序列的？说明逆转录病毒是如何转导真核细胞序列的？4、简述质粒、简述质粒DNA特性。特性。5、试述大肠杆菌同源重组的、试述大肠杆菌同源重组的RecBCD途径及参与途径及参与 的重组酶。的重组酶。6、同源重组与位点特异重组有何不同？、同源重组与位点特异重组有何不同？7、简述人类抗体多样性产生的机制。、简述人类抗体多样性产生的机制。
