1、液质联用的原理及在药学研究中的应用1PPT课件目录一、液质联用的原理二、液质联用的应用2PPT课件 LC:液湘色谱仪 一种能够把液体混合物中的不同组分根据在色谱柱中保留时间不同进行分离,检测及收集的仪器 MS:Mass Spectrometer 质谱仪 一种能够把分子转化生成带电离子,并在气态中根据质荷比(m/z:m质量 z分子所带电荷数)的不同把离子进行分离并进行检测的仪器.一、液质联用的原理3PPT课件液质联用的原理液质联用液质联用(LC-MS)：不挥发性化合物分析测定，极性化合物的分析测定，热不稳定化合物的分析测定，大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定4PPT课件用液相或
2、注射泵将样品注 入质谱.1.样品注入样品注入样品在离子源内电离,带电离子在接口内进行去溶剂,聚集,冷却进入质量分析器2.离子化离子化四极杆用于传输离子或选择母离子和子离子,.离子通过聚焦和传输进入下一组四极杆3.质量分析器质量分析器四极杆四极杆检测器记录离子的信号.然后将信号传输到电脑绘制成色谱图.4.离子检测和数据分析离子检测和数据分析Q0Q1Q3DFCEMORSKEXIT Q2(LINAC)5.真空系统真空系统5PPT课件 连续注射连续注射样品放在注射器中或静态的针内用注射泵或电场引力,样品流连续并恒定地流入离子源喷口通常用于安装时调谐通常用于安装时调谐,质量校正质量校正 和标准样品质谱方
3、法的优化和标准样品质谱方法的优化 流动注射分析流动注射分析用手动进样器和液相泵,注入样品,由流动相带入离子源喷口通常安装通常安装5ul的定量环的定量环 液质联用液质联用用液相的泵,流速从 nL/min 到 mL/min样品可能是纯品或者是混合物流动相带着样品经过色谱柱分离后进入质谱的离子源1、样品注入6PPT课件2、离子源 大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）ESI 为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大的样品效果好一些；APCI 为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对
4、其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好。APPI：大气压光电离源，适用于弱极性的化合物，如多环芳烃等7PPT课件2.1 ESI离子源 ESI 为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大的样品效果好一些；电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质8PPT课件 APCI 为大气压力化学电离
5、源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好。有些分析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子，所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子，主要是准分子离子。2.2 APCI离子源9PPT课件 API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；10PPT课件大气压电
6、喷雾质谱应用范围大气压电喷雾质谱应用范围大气压电喷雾源大气压电喷雾源大气压化学源大气压化学源分子量分子量化合物极性化合物极性1000100,00010,000非极性非极性极性化合物极性化合物气相色谱气相色谱/质谱质谱11PPT课件3、质量分析器-四级杆（quadrupole mass spectrometer）不稳定的离子不稳定的离子稳定的离子稳定的离子离子源离子源检测器检测器直流和交流控制电信号直流和交流控制电信号12PPT课件ABBA To Detector去检测器去检测器AABBRF only-A rods&B rodsare 180 out of phase只加交流信号只加交流信号-A
7、杆与杆与B杆上杆上加的电压强度相同加的电压强度相同,相位差相位差180度度13PPT课件14PPT课件15PPT课件离子在四极杆中的稳定性16PPT课件4、离子检测 MS/MS 必须通过连续放置多个分析器来实 现空间串联的多级质谱分析。对于QQQ，每个分析器有以下单独的作用：第一个四极杆(Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离 子。第二个四极杆(Q2)，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等。第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。17PPT课件三重四极杆基本功能Q1 可以筛选母离子 mz1Q2 通过碰撞碎裂打碎离子，形成碎片离子峰
8、Q3 筛选子离子，定量子离子碎片强度 mz218PPT课件三重四极杆工作模式模式Q1 扫描Q1扫描离子Q2不打碎，传输Q3无分辨，传输用途和特点了解样品基本信息子离子扫描固定过滤母离子打碎母离子扫描子离子研究母离子的结构特征母离子扫描扫描母离子打碎母离子固定过滤子离子筛选具有特征子离子（结构）的分子中性丢失单离子监视 SIM多反应检测MRM扫描母离子按表过滤离子按表过滤母离子打碎离子不打碎，传输打碎母离子扫描子离子，与母离子有特征差异无分辨，传输按表过滤子离子筛选具有特征结构的分子，此结构不易形成子离子定量定量，假阳性低19PPT课件QQQ多级质谱：子离子扫描 Q1选择了某一特定质量的母离子，
9、Q2碰撞池产生碎片离子，然后在Q3中分析。此过程产生典型的质谱质谱碎片谱图。第一个四极杆在选择性离子监测模式，第二个在全扫描监测模式20PPT课件QQQ多级质谱：母离子扫描 在母离子扫描中，Q1测定母离子，Q3测定某个特定的碎片离子，因此可在非常复杂的混合物中监测某种特定的分子。在下面的例子中，睾丸激素在母碎片（m/z 367）中碎片m/z 97得到选择性监测，具有极高的灵敏度和精确的定量分析。21PPT课件QQQ多级质谱：中性丢失扫描l 在QQQ中进行中性丢失扫描，Q1和Q3分析器的结合使灵敏度 和选择性得到最大化。Q1/Q3中性丢失扫描可监测母离子特定的中性丢失，例如缩氨酸磷酸盐中一个磷酸
10、根的丢失。在这个例子中，Q1和Q3的扫描得到母离子的谱图，这张谱图是母离子为了磷酸化，丢失了碎片98而得到的22PPT课件QQQ多级质谱：单个反应监测(SRM)l 选择某一质量的母离子，Q2碰撞单元产生碎片离子。Q3只分析一个碎片离子。此过程产生一个简单的单个离子碎片谱图23PPT课件QQQ多级质谱：多反应监测l Q1选择某一质量的母离子，碰撞单元产生碎片离子。Q3用于搜寻多个选择反应监测，这就是多重反应监测（MRM）。24PPT课件MRM 假阳性率较低的原因利用母离子和子离子的共同特征，定量选择性提高例如：如果样品 A 母离子 697 和样品 B542 在打碎后都具有子离子 245如果直接以
11、特征离子 245 定量 A697，那么样品 B 就会对样品 A 的定量造成干扰而利用离子对 697-245 定量，B542 在 A697 通过 Q1 时无法通过 Q1，这样就排除了B542 的干扰697EI24554225PPT课件三重四极杆与其他液相/质谱联用技术的比较质谱联用技术的比较 在质谱应用领域里三重四极杆是最灵敏和定量重现性最好 的仪器。在质谱应用领域里三重四极杆在执行中性丢失扫描和母子扫描模 式具有最好的灵敏性和准确性。三重四极杆不是最好的获取质谱图的仪器，平行测量的质谱系统 会更好些：三重四极杆质谱/质谱不如离子阱质谱仪（TRAPS）灵敏（定性）三重四极杆质谱不如飞行时间质谱仪
12、（TOF）所获取的质谱图那么 有说服力（定性）26PPT课件二、LC-MS/MS应用 高效液相色谱分离化合物范围广泛，准确度高，对化合物破坏性小。质谱灵敏度高，对未知化合物的结果分析定性准确，对被测定化合物和形影标准样品的了解要求较低。将HPLC的高效分离能力与MS高专属性高灵敏度检测功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定性和定量分析。27PPT课件28PPT课件优点：测定准确分子量，其他技术无法比。灵敏度高，常规10-710-8g，单离子检测可达10-12g 分析速度快 便于分离、分析混合物其他技术无法胜任 广泛适用于各类化合物局限性：异构体、立体化学区分能力差 重复性差，需专人操作 离子
13、源产生记忆效应、污染等。价格贵，操作复杂，实验环境要求高。29PPT课件 医药学：药物代谢、药动学、杂质分析、天然产物分析 生物化学：多肽、蛋白质、核酸、糖 环境化学：农药、农残分析、有机物污染、土壤/食品/水分析 临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白、血红蛋白变异、胆酸 食品科学：香料、添加剂、包装物、蛋白质、致癌物 法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测 化学：合成、表面活性剂、染料30PPT课件在药品研发中的应用 药物研发、生产过程中，微量杂质和副产物的定性鉴定。潜在基因毒杂质的定量分析。LC-MS分析条件的选择考虑两个因素：1、使分析样品得到最佳分离条件 2、得到最佳电离条件以获得更好的灵
14、敏度 当进行单离子检测时，如果没有介质效应，不用将物质完全分开便可以检测，这样既减少了分析时间，也可以降低分析难度，尤其是在进行大量体内药物分析时可以考虑。31PPT课件影响LC/MS测定的因素pH影响 检测正离子，酸化样品 检测负离子，碱化样品常用的pH调节溶剂 乙酸 pH 34 甲酸 pH 23 三氟乙酸 pH 12 氨水溶液 甲酸铵 乙酸铵32PPT课件溶液和缓冲剂的组成ESI离子源APCI源以上均可用不适合：不挥发性盐：磷酸及盐、硼酸及盐、氯化钠、十二烷基硫酸钠、强离子对试剂等33PPT课件样品浓度的影响样品浓度过低：检测不出样品浓度过高：污染离子源、仪器管路（特别是表明活性剂）产生簇
15、离子或多聚体-谱图复杂化 产生空间电荷效应-谱图歧变34PPT课件2、基质效应 基质效应（matrix effect）是由于样品中存在干扰物质，对响应造成直接或间接的影响。LC-MS分析时，内源性物质使待测物的离子化效率降低或者增强。产生原因：待测组分与样品中基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争。结果显著的降低或增强目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确度。使得信号的响应值产生较大变异。35PPT课件 LC-MS分析时基质效应客观存在，并随样品不同而不同。影响基质效应的因素很多，如样品、基质、样品前处理过程、色谱条件、色谱分离效果、流动相、离子化等。优化色谱条件 改进前处理
16、方法纯化样品 改变离子化方式 内标定量法36PPT课件样品前处理 过滤（0.45um滤膜）、超滤（3K、10K、30K等）溶剂萃取（去除杂质Na+、K+等）高速离心（去除不溶物）透析（常用于蛋白纯化、除盐）固相萃取（除杂质、盐、浓缩样品、更换溶剂等）分子筛（常用于蛋白纯化）色谱分离（正相、反相、亲和）37PPT课件联用时的主要问题 难挥发和/或不稳定样品的离子化 流速不兼容 流动相不兼容：不挥发缓冲盐、添加剂等38PPT课件APCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物的分析氨基甲酸盐类化合物的分析mAUmin51015202520406080UV 254 nmTomato extract spike
17、d with 11 carbamatesNorm.4000080000120000EIC m/z 222MS TICcarbofuran39PPT课件 药物中的杂质含量低、来源广、结构多与主成分类似，必须选择合适的分析技术进行研究。LC-MS 联用技术结合了色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点，在食品分析、环境分析和医药研究等许多领域已得到了广泛应用。随着联用技术的日趋完善，以及色谱、质谱新技术的应用，LC-MS 联用技术成为杂质分析中广泛采用的方法。40PPT课件 在杂质谱分析中：对药物中存在的已知杂质进行鉴别的同时也能对未知杂质进行结构推导 在工艺杂质分析中：可以直接鉴定杂质的化学结构，从而为原料药的质量控制、合成工艺的改进提供依据 在降解产物研究中：对药物在实际储藏条件下产生的降解产物进行分析，可为药物的储藏、运输及使用的整个过程中的存放条件提供依据41PPT课件42PPT课件
