1、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH)(FISH)在在临床病理中的应用与质控临床病理中的应用与质控广西至科大学一附院病理科 王华.荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH):(FISH):用带有用带有荧光素荧光素标记的标记的核酸探针核酸探针与组织细与组织细胞中待测的核酸胞中待测的核酸(DNA、RNA)按碱基配对按碱基配对的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下显示细胞基因状态的方法。显示细胞基因状态的方法。FISHFISH在临床病理中的应用在临床病理中的应用辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗.一、常用荧光素及滤光片类
2、型荧光素颜色荧光素颜色激发波长激发波长 发射波长发射波长常用滤光片常用滤光片Red(Red(红色红色)592592612612RedRed单通道单通道Orange(Orange(橙色橙色)559559588588OrangeOrange单通道单通道G/OG/O双通道双通道Green(Green(绿色绿色)497497524524GreenGreen单通道单通道G/OG/O双通道双通道Aqua(Aqua(青蓝色青蓝色)433433480480AquaAqua单通道单通道DAPI(DAPI(蓝色蓝色)367367452452BlueBlue单通道单通道.二、常用探针种类 单色探针单色探针(sing
3、le color probe,SC)(single color probe,SC)双色探针双色探针(dual color probe,DC)(dual color probe,DC)三色探针三色探针(triple color probe,TC)(triple color probe,TC)双色分离探针双色分离探针(dual color,break apart probe.DC,BCR)(dual color,break apart probe.DC,BCR)双色单融合探针双色单融合探针(dual color,single fusion.DC,SF(dual color,single fusio
4、n.DC,SF Trans)Trans)额外信号探针额外信号探针(extra signal.ES)(extra signal.ES)双色双融合探针双色双融合探针 (dual color,dual fusion probe.DC,DF Trans)(dual color,dual fusion probe.DC,DF Trans).单色探针(SC)正常正常异常异常CEP8.双色探针(DC)正常正常异常异常HER2CEP17.三色探针(TC)正常正常异常异常XYCEP18.双色分离探针(DC,BCR)正常正常异常异常MYCMYC14181418.双色单融合探针(DC,SF Trans)正常正常异常
5、异常ABLABL922922BCRBCR.额外信号探针(ES)正常正常异常异常ABLABL922922BCRBCR.双色双融合探针(DC,DF Trans)正常正常异常异常IGHIGH14181418BCL2BCL2.三、三、FISHFISH检测检测在常见肿瘤中的应用与意义在常见肿瘤中的应用与意义.乳腺癌 探针探针:HER2/CSP17:HER2/CSP17（双色探针）（双色探针）HER2HER2基因检测意义：基因检测意义：HER2HER2基目扩增的患者预后差基目扩增的患者预后差:无病生存和总生存期缩无病生存和总生存期缩短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。指导内
6、分泌冶疗：指导内分泌冶疗：HER2HER2基因扩增患者对内分泌治疗产基因扩增患者对内分泌治疗产生耐药。生耐药。指导合理选择辅助化疗方案：指导合理选择辅助化疗方案：HER2HER2基因扩增患者宜采基因扩增患者宜采用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。筛选分子靶向药物的适用者：筛选分子靶向药物的适用者：HER2HER2基因扩增患者适合基因扩增患者适合使用曲妥珠单抗药物。使用曲妥珠单抗药物。.Her2(-)2G+2R Ratio:1/12.2/1,Her2 FISH(+).探针：探针：TOP2A/CSP17TOP2A/CSP17（双色探针）（双色探针）TOP2A
7、基因两种异常：扩增和缺失。基因两种异常：扩增和缺失。TOP2ATOP2A基因检测的意义：基因检测的意义：存在存在TOP2A基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失的患者预后更差。的患者预后更差。TOP2A基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更敏感。敏感。.非小细胞肺癌 探针：探针：EGFR/CSP7EGFR/CSP7（双色探针）（双色探针）EGFR基因异常：扩增和拷贝数增加。基因异常：扩增和拷贝数增加。EGFREGFR基因检测的意义：基因检测的意义：30%40%非小细胞肺癌存在非小细胞肺癌存在EGFR基因异常基因异常.筛
8、选酪氨酸激酶抑制剂适用者：筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者：EGFR基因基因增多的患者，应用增多的患者，应用Iressa/Tarceva治疗的有效率为治疗的有效率为35%，疾病控制率高达，疾病控制率高达70%。.EGFR(-)2G+2R Ratio:2.0,EGFR FISH(+).滤泡性淋巴瘤 探针探针:BCL2/IGH:BCL2/IGH（双色双融合探针）（双色双融合探针）BCL2BCL2基因位于基因位于18q2118q21，IGH IGH基因位于基因位于14q32.BCL2/IGH14q32.BCL2/IGH融合基因导致融合基因导致BCL2BCL2蛋白的过度表达，从而抑制蛋白的过度表达，从而抑制
9、B B细胞凋亡，细胞凋亡，使使B B细胞持续增殖引发肿瘤。细胞持续增殖引发肿瘤。BCL2/IGHBCL2/IGH融合基因检测意义融合基因检测意义:辅助诊断辅助诊断FL FL：BCL2/IGHBCL2/IGH重排发生在约重排发生在约80%-85%80%-85%的的FLFL患患者中。者中。BCL2/IGH BCL2/IGH持续阴性的持续阴性的FLFL患者患者3 3年生存率为年生存率为100%100%，而阳，而阳性者性者3 3年生存率只有年生存率只有54%54%；阴性者；阴性者3 3年疾病无进展的患者年疾病无进展的患者87.5%87.5%，而阳性者只有，而阳性者只有13%13%。.BCL2/IGH
10、正常BCL2/IGH断裂、平衡易位.弥漫性大B细胞淋巴瘤 探针：探针：BCL6（双色分离探针）（双色分离探针）BCL6BCL6基因位于基因位于3q273q27，主要有，主要有t(3;14)t(3;14)，t(3;22)t(3;22)和和t(2;3)3t(2;3)3种易位，分别是种易位，分别是BCL6BCL6与免疫球蛋白与免疫球蛋白IgIg的重链的重链(IGH)(IGH)、轻链轻链(IGL)(IGL)、轻链轻链(IGK)(IGK)区域易位。区域易位。BCL6 BCL6 基因断裂检测意义基因断裂检测意义 目前研究确定至少目前研究确定至少40%40%的的DLBCLDLBCL涉及涉及3q273q27染
11、色体易位或染色体易位或者者BCL6BCL6基因重排。基因重排。BCL6 BCL6阳性患者诊断治疗阳性患者诊断治疗3636个月后，疾病停止发展的比个月后，疾病停止发展的比率为率为82%82%，携带有，携带有BCL6BCL6重排的病例预后较好。重排的病例预后较好。.BCL6断裂断裂BCL6正常正常.套细胞淋巴瘤 探针：探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）（双色双分离探针）CCND1CCND1基因位于基因位于11q1311q13，IGHIGH基因位于基因位于14q3214q32。CCND1/IGHCCND1/IGH融合基因导致融合基因导致CCND1CCND1蛋白过度表达，可促进细胞蛋白过度表达
12、，可促进细胞增生。增生。CCND1/IGHCCND1/IGH融合基因检测意义融合基因检测意义 CCND1 CCND1基因重排和基因重排和(或或)高表达是高表达是MCLMCL的特征，的特征，FISHFISH探探针检测针检测CCND1/IGHCCND1/IGH的阳性率可以达到的阳性率可以达到96%96%。.CCND1/IGH正常正常CCND1/IGH断裂易位断裂易位.伯基特淋巴瘤 探针探针:C-MYC（双色分离探针）（双色分离探针）8号染色体上号染色体上C-MYC基因最常见的是基因最常见的是t(8；14)，导致，导致8号染色体上号染色体上C-MYC基因和基因和l4号染色体上号染色体上IGH增强子元
13、件并列增强子元件并列,也可发生也可发生t(2；8)(p12；q24)，或，或t(8；22)(q24；ql1)C-MYCC-MYC基因断裂检测意义基因断裂检测意义 约约80%的伯基特淋巴瘤病例发生的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)（q24;q32）；）；约约15%的伯基特淋巴瘤病例发生的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)；约约5%发生发生t(8；22)（q24;q11）。）。C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。.C-MYC正常正常C-MYC断
14、裂断裂.MALT淋巴瘤 探针：探针：MALT1（双色分离探针）（双色分离探针）API2/MALT1（双色双融合探针）（双色双融合探针）API2（11q21）MALTI（18q21）易位形成）易位形成API2/MALTI融合基因，产生融合基因，产生API2/MALTI融合蛋白，导致细融合蛋白，导致细胞增殖，引起肿瘤胞增殖，引起肿瘤。MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义融合基因检测意义 10%-20%的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在MALT1 基基因的断裂重组，辅助诊断因的断裂重组，辅助诊断MALT淋巴瘤。淋巴瘤。指导针对胃指导针对胃API1/MALT1淋巴
15、瘤患者的抗幽门螺旋菌治淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治疗：疗：存在存在MALT1 基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治疗。疗。预后判断：存在预后判断：存在MALT1 基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤患者更容易出现局部进展期病变。患者更容易出现局部进展期病变。.MALT正常MALT断裂API2/MALT正常API2/MALT断裂易位.滑膜肉瘤 探针：探针：SYT SYT SYT基因位于基因位于18q1118q112,2,又称又称SSl8SSl8或或SSXTSSXT基因基因 。SYT基因检测意义基因检测意义 辅助诊断滑膜肉瘤。辅助诊断滑膜肉瘤。
16、文献报道，文献报道，9090以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位t(Xt(X；18)(p1118)(p112 2；q11q112)2)，导致位于，导致位于18q1118q112 2的的SYTSYT基基因和位于因和位于Xp11Xp112 2的的SSXSSX基因融合。基因融合。.脂肪肉瘤 探针：探针：MDM2/CEN12 MDM2MDM2基因检测意义：基因检测意义：辅助诊断高分化脂肪肉瘤。辅助诊断高分化脂肪肉瘤。文献报导：文献报导：90%高分化脂肪肉瘤中高分化脂肪肉瘤中MDM2基因存在扩基因存在扩增。增。.胃肠道间质瘤 探针：探针：CCND1/CEN11 MDM2/CEN1
17、2 检测意义：检测意义：CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、复发等相关。在高凤险们复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等中扩增，在低风险和中等风险风险GIST中无扩增，其表达与中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。有预后相关性。MDM2基因扩增宣基因扩增宣GIST患者有预后相关性。患者有预后相关性。.前列腺癌 探针：探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG 检测意义：检测意义：PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。基因缺失，前列腺癌患者预后差。FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重要基因扩增是前列腺癌患
18、者传递激素抵抗的重要过程。过程。没有没有ERG基因改变的前列腺癌患者基因改变的前列腺癌患者8年生存期达年生存期达90%。.神经母细胞瘤、神经胶质瘤 探针：探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11 检测意义：检测意义：在神经母细胞瘤患者中，在神经母细胞瘤患者中，1p丢失是强烈的预后差因子，丢失是强烈的预后差因子，提示临床应采取积极主动的治疗策略；提示临床应采取积极主动的治疗策略；结合结合1p，19q基因状态可辅助治疗和预测退行性少突基因状态可辅助治疗和预测退行性少突神经胶质瘤的预后效果。神经胶质瘤的预后效果。NMYC基因扩增为预后差因子，指导个性化治疗。基因扩增为预后
19、差因子，指导个性化治疗。.黑色素瘤 探针：探针：PTEN/CEN10 检测意义：PTEN基因缺失导致基因缺失导致PI3K/AKT（磷酸肌醇（磷酸肌醇3激酶激酶/丝丝氨酸苏氨酸蛋白激酶氨酸苏氨酸蛋白激酶）途经激活，指导抗）途经激活，指导抗PI3K/AKT通路通路药物。药物。PTEN基因缺失的患者预后差。基因缺失的患者预后差。.宫颈CIN、宫颈癌 探针：探针：TERC/CSP3 检测意义：对于对于CIN1/CIN2的患者，的患者，TERC基因扩增的患者发基因扩增的患者发生进展生进展/恶变的可能性超过恶变的可能性超过50%，需要及时治疗。，需要及时治疗。辅助明确宫颈辅助明确宫颈CIN分级，选择合理的
20、治疗方案。分级，选择合理的治疗方案。病埋分级病埋分级正常正常/炎症炎症CIN1CIN2CIN3原位癌原位癌TERC扩增率扩增率4.2%7.3%69.2%85.1%95.7%.膀胱癌 探针：探针：CSP3/CSP7 P16/CSP17 检测意义：膀胱癌膀胱癌9 9号染色体部分号染色体部分(P16(P16位点位点)缺失或全部丢失是最缺失或全部丢失是最常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密切相关。切相关。膀胱癌的发展与染色体不稳定性膀胱癌的发展与染色体不稳定性(如如3 3号、号、7 7号、号、1717号号染色体的非整倍性染色体的非整倍性)
21、紧密相连。紧密相连。早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。.四、FISH操作流程 石蜡切片石蜡切片58-6058-60过夜过夜 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织 高压处理组织切片高压处理组织切片 胃蛋白酶处理组织胃蛋白酶处理组织 干燥组织切片后滴加探针，加盖玻片与封固剂干燥组织切片后滴加探针，加盖玻片与封固剂 高温（高温（73957395）变性）变性 杂交杂交1616小时（过夜）小时（过夜）揭去橡胶水泥和盖玻片揭去橡胶水泥和盖玻片,进入杂交后洗涤进入杂交后洗涤 酒精
22、脱水、晾干。酒精脱水、晾干。滴加滴加DAPIDAPI荧光封片剂荧光封片剂 荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察 .五、五、FISHFISH判读标准判读标准 乳腺癌乳腺癌HER2HER2基因检测基因检测:20个肿瘤细胞个肿瘤细胞HER2基因（红信号）点数总基因（红信号）点数总和与和与CEN-17（绿信号）点数总和的比值。（绿信号）点数总和的比值。HER2/CEN-172.2 HER2基因有扩增基因有扩增 HER2/CEN-171.8 HER2基因无扩增基因无扩增 HER2/CEN-17 1.82.2 定为不确定结果。定为不确定结果。需重新再进行另外需重新再进行另外20个的细胞计数或重复个的细胞计数或
23、重复FISH检测，如仍不确定，则建议临床结合检测，如仍不确定，则建议临床结合IHC检检测测HER2蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。.CEN-17多体性：计算以上计数的多体性：计算以上计数的20个细个细胞的绿信号点数均值。胞的绿信号点数均值。CEN-17均值均值 1.75 亚二体性亚二体性 CEN-17均值均值 1.762.25 二体性二体性 CEN-17均值均值 2.263.75 低多体性低多体性 CEN-17均值均值 3.76 高多体性高多体性.非小细胞肺癌非小细胞肺癌EGFREGFR基因检测基因检测:50个肿瘤细胞个肿瘤细胞EGFR基因（红信号）点数总基
24、因（红信号）点数总和与和与CEN-7（绿信号）点数总和的比值。（绿信号）点数总和的比值。EGFR基因扩增阳性：基因扩增阳性：EGFR基因簇状扩增基因簇状扩增 EGFR/CEN-72.0 40%肿瘤细胞红色信号肿瘤细胞红色信号4个个.六、六、FISHFISH检测规范与质控检测规范与质控 影响影响FISHFISH制片质量的因素制片质量的因素 组织处理的规范化组织处理的规范化:及时固定及时固定:冷缺血时间冷缺血时间1h1h 4%4%中性缓冲甲醛中性缓冲甲醛6-48h6-48h 不推荐微波固定不推荐微波固定 乙醇脱水乙醇脱水 浸蜡温度浸蜡温度686周的组织切片不应再用于周的组织切片不应再用于FISH检
25、测检测.影响影响FISHFISH判读的因素判读的因素 采用正确的滤光片观察采用正确的滤光片观察 Orange/red Orange/red 正确判定肿瘤细胞正确判定肿瘤细胞(HEIHCFISH)(HEIHCFISH)肿瘤异质性表达肿瘤异质性表达 导管内癌导管内癌/浸润性癌浸润性癌 浸润性癌不同部位浸润性癌不同部位 至少两位阅片者至少两位阅片者 .导管内癌导管内癌浸润性导管癌浸润性导管癌.免疫组化技术、蛋白组学技术的发展免疫组化技术、蛋白组学技术的发展2121世纪初蛋白质指纹图谱技术建立世纪初蛋白质指纹图谱技术建立新蛋白质种类的发现新蛋白质种类的发现免疫组化抗体种类免疫组化抗体种类对临床病理的影响对临床病理的影响10年时间年时间.DNADNA测序技术的进步测序技术的进步人类基因组计划初步完成人类基因组计划初步完成 于于20002000年完成测定人体年完成测定人体2323对染色体全部对染色体全部DNADNA序列，完成人类基因组序列，完成人类基因组“工作框架图工作框架图”。20012001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。人类基因组研究进入规模化人类基因组研究进入规模化荧光原位杂交技术的发展荧光原位杂交技术的发展FISHFISH探针的种类探针的种类对临床病理的影响对临床病理的影响.
