1、实验十实验十流感病毒的分离鉴定（二）流感病毒的分离鉴定（二）1、血细胞凝集实验、血细胞凝集实验2、血细胞凝集抑制试验、血细胞凝集抑制试验 目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。原理：流感病毒颗粒表面有血凝素原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠具有使鸡、豚鼠等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象，检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象，即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝
2、抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。实验材料实验材料(1)接种流感病毒的鸡胚。接种流感病毒的鸡胚。(2)质量分数为质量分数为05的鸡红细胞悬液。的鸡红细胞悬液。(3)流感病毒型与亚型免疫血清。流感病毒型与亚型免疫血清。(4)碘酒，酒精消毒棉球。碘酒，酒精消毒棉球。(5)灭菌的镊子、剪刀。灭菌的镊子、剪刀。(6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。无菌小试管，毛细滴管
3、，吸管。(7)生理盐水。生理盐水。(8)试管、试管架。试管、试管架。实验方法：实验方法：1、血细胞凝集实验、血细胞凝集实验(1)收获尿囊液：鸡胚孵育收获尿囊液：鸡胚孵育3d后后,放放4度冰箱过夜度冰箱过夜,次日次日取出鸡胚取出鸡胚,消毒气室端卵壳消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处用小镊子在无大血管处撕破卵膜撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管放入无菌试管中。中。(2)取尿囊液取尿囊液01mL,作作1：10稀释。稀释。(3)取取10支小试管，按给各管加入生理盐水支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。(4)取取1：10稀释的尿囊液稀释的尿囊液02mL，加人第，
4、加人第1个试管个试管中，混匀后，再吸出中，混匀后，再吸出02mL加入第加入第2个试管中；个试管中；混匀后，从第混匀后，从第2个试管吸出个试管吸出02mL加入第加入第3个试个试管管依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9个试管中取出个试管中取出02mL弃掉。这样各管液体量均弃掉。这样各管液体量均为为02mL，从第，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为个试管的尿囊液稀释度为1:20，1:40，1:5120，第，第10个试管为生理个试管为生理盐水对照管。盐水对照管。(5)稀释完毕后加人体积分数为稀释完毕后加人体积分数为05的压积鸡红的压积鸡红细胞悬液，每管细胞悬液，每管02
5、mL,室温放置室温放置3060mn。流感病毒血凝试验试管号试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10生理盐水生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2病毒液病毒液(1:10)0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃弃0.2病毒稀释度病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对对照照0.5%鸡红细胞鸡红细胞 0.2 0.2 0.
6、2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温摇匀置室温6090分钟分钟结结 果果 +试管号试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10生理盐水生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2病毒液病毒液(1:10)0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃弃0.2病毒稀释度病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:512
7、0 对照对照0.5%鸡红细胞鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温摇匀置室温6090分钟分钟结结 果果 +(6)结果观察结果观察观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然后再观察试验管，各管出现的凝集程度以后再观察试验管，各管出现的凝集程度以“+”、“+”、“+”、“+”、“”表示，判断标准表示，判断标准如下：如下：“+”：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐。边缘不整齐。“+”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞
8、：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不不凝，在管底中心形成小红点。凝，在管底中心形成小红点。“+”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。“”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。凝集效价：能使红细胞呈能使红细胞呈
9、“+”凝集的病毒最高稀释凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如表，第如表，第6个试管为个试管为“+”，且病毒稀释度最高，则该病，且病毒稀释度最高，则该病毒悬液效价为毒悬液效价为1:640，即该病毒悬液稀释到，即该病毒悬液稀释到1：640时，每时，每02mL中含有一个血凝单位，配制中含有一个血凝单位，配制4个血凝单位的病毒悬个血凝单位的病毒悬液时，病毒液应稀释成液时，病毒液应稀释成(1：640)X4，即，即1：160。2、血细胞凝集抑制试验 试试 管管1 待测待测 2 待测待测3 血清对照血清对照4 抗原对照抗原对照5 红细胞对照红细
10、胞对照 生理盐水生理盐水1：5血清血清4u病毒液病毒液0.5鸡红鸡红细胞细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.40.2按表加入材料和试剂按表加入材料和试剂 结果观察结果观察先观察先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红细胞对照不发生凝集，再观察试验管。细胞对照不发生凝集，再观察试验管。血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该血清的抑制效价。血清的抑制效价。鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊断，恢复期比初期抗体效价增高断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有诊断意义。倍以上才有诊断意义。
