1、血清学诊断在结核病血清学诊断在结核病中临床应用价值中临床应用价值结核病的历史 纪元前一万年纪元前一万年 纪元前纪元前500500年年 汉唐隋时代汉唐隋时代 1650年年 命名结命名结核核1865年年 证实结核证实结核病具有传病具有传染性染性 1882年年 发现发现结核结核菌菌1921年年 卡介苗卡介苗1944年年 1908年年 结核菌结核菌素皮试素皮试链霉素链霉素1952年年 异烟肼异烟肼1966年年 利福平利福平1971年年 短程化短程化疗疗1995年年 DOTS策略策略STOP TB策略策略2005年年 2结核病的今天全球范围内结核病疫情急剧恶化全球范围内结核病疫情急剧恶化 结核病及艾滋病
2、同时流行结核病及艾滋病同时流行 结核菌耐药现象益发严重结核菌耐药现象益发严重 人口大规模流动人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 结核菌感染率结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者新发活动性结核患者130万万/年年 死亡死亡13万万/年年早期快速诊断及治疗成为制约结核病控制的关键早期快速诊断及治疗成为制约结核病控制的关键 常规实验室诊断结核病方法阳性率不到常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%3结核病的数字结核病的数字全世界约全世界约1/3的人口（近的人口（近20亿）亿）携带结核菌。携带结核菌。自自1882年以来已经有年以来已经有2亿人
3、亿人死于死于结核病。结核病。每年有每年有2000万人万人患活动性结核病。患活动性结核病。每年约有每年约有300万人万人死于结核病。死于结核病。结核病每结核病每15秒钟秒钟就杀死就杀死1人。人。预计未来预计未来20年还将有年还将有3600万人万人死死于结核病。于结核病。4结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性抗酸染色阳性5实验室检查方法的历史实验室检查方法的历史1880sTubercle bacilli的发现 Z
4、iehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test(TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培养基1940sDubos agar,Ogawa 培养基1950sMiddlebrook 7H91990s核酸扩增方法2000sELISPOT,QuantiFERON20XX?6当前结核研究的热点当前结核研究的热点 新型抗结核药物新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗新型结核疫苗(10%)7结核
5、病的实验室诊断结核病的实验室诊断 细菌学细菌学涂片：涂片：敏感性低敏感性低传统固体培养：传统固体培养：所需时间长，所需时间长，23月月 分子生物学分子生物学TB-DNATB-RNAHAIN技术技术Xpert MTB/RIFDNA微阵芯片微阵芯片 血清血清/免疫学免疫学IGRA：有望替代有望替代TST，但，但不能区分不能区分活动性活动性TB及潜伏感及潜伏感染染血清学：血清学：存在抗原存在抗原纯度和特纯度和特异性差等异性差等方面的问方面的问题题液体培养及药液体培养及药敏试验：平均敏试验：平均时间时间20天天8血清学诊断技术血清学诊断技术血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。血清学
6、诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备无需活细胞培养和特殊仪器设备 操作简便操作简便 结果显示快速结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法免疫印迹法(Western Blotting)等等等等9脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结有较
7、强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。核病的血清学诊断应用较广的抗原。有关有关LAM抗原的应用报道很多抗原的应用报道很多,Antunes等用美国生产的结明等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为，特异性为92.4%，认为检，认为检测测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。10A60(antigen 60)A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，
8、是脂质蛋白和多糖的复合抗原。糖的复合抗原。Wu等用等用ELISA法检测了法检测了178例活动性肺结核患者和例活动性肺结核患者和151例其他疾病患例其他疾病患者血清中的者血清中的IgG A60，根据受试者工作特性曲线，根据受试者工作特性曲线(ROC)取取261.2单位为单位为截切值截切值(cutoff point)，其敏感性和特异性分别为，其敏感性和特异性分别为49.4%和和79.5%，认，认为胸部为胸部X片异常的患者结合片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的准确临阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。床诊断。11结核菌糖脂(TBGL)抗原 结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物
9、质，具有菌属特异性。近结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。近年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。Maekura等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为56.8，对痰培养阴性的活动性肺结核，对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为的灵敏度为51.2。将。将TBGL及核酸扩增方法及核酸扩增方法(NAA)联合用于检测，检出率联合用于检测，检出率比两者单独使用时进一步提高。比两者单独
10、使用时进一步提高。Tiwari等用脂质体颗粒作为载体，利用纯等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的化的TBGL抗原特异的及结核病患者血清中的抗原特异的及结核病患者血清中的TBGL抗体结合，形成蓝色凝抗体结合，形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达94%和和98.3%。该方。该方法快速法快速(4min)、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗(BCG)免疫接种者免疫接种者及健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。及健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。1238kDa蛋白 38kDa蛋白是一定
11、位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达，达，BCG合成合成38kDa蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。38kDa 蛋白为一分泌蛋白，可刺激蛋白为一分泌蛋白，可刺激T细胞和细胞和B细胞免疫反应，广泛应用于结细胞免疫反应，广泛应用于结核病的血清学试验。核病的血清学试验。英国公司生产的英国公司生产的OMEGA结核抗体定量检测结核抗体定量检测Myco G、A、M试剂盒联合应用试剂盒联合应用38kDa和脂多糖和脂多糖(LPS)抗原，而抗原，而TB Complex Plus试剂盒选用的是试剂盒选
12、用的是38kDa和和16kDa抗原。抗原。Butt等对等对OMEGA试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的TB Complex Plus和有属特异性的和有属特异性的Myco M联合应用可取得最好的效果，检测肺联合应用可取得最好的效果，检测肺结核的敏感性和特异性分别为结核的敏感性和特异性分别为87%和和93%。38kDa对活动性肺结核的诊断非对活动性肺结核的诊断非常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有 30%以上的交叉，所以对不同人群的以上的交叉，所以对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并H
13、IV感染的结核病患者效果较差。感染的结核病患者效果较差。13Ag85 抗原85复合体(Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约为为3032kDa。分枝杆菌各菌株均可分泌。分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。结核分枝杆菌。结核分枝杆菌Ag85中至少包中至少包括三种蛋白成分括三种蛋白成分Ag85A、Ag85B和和Ag85C，其中有免疫作用的主要为，其中有免疫作用的主要为Ag85A和和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞
14、壁合成的最后阶段发挥必要的作用。它还能和人纤连蛋白必要的作用。它还能和人纤连蛋白(FN)相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。Ag85可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的Ag85抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50150倍，可倍，可通过检测血循环中通过检测血循环中Ag85抗体，对活动性结核加以诊断。抗体，对活动性结核加以诊断。Kashyap等用间接等用间接ELISA法检测法检测89%疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在疑似结核
15、性脑膜炎患者脑脊液中存在Ag85抗体，认为检测抗体，认为检测Ag85抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。14ESAT-6和CFP10 ESAT-6即即6kDa早期分泌性抗原，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯早期分泌性抗原，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。的免疫回忆应答中起重要作用。ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆
16、菌、仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而型分枝杆菌，而BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。及其他非致病性分枝杆菌缺失。CFP-10即培养滤液蛋白即培养滤液蛋白10，及，及ESAT-6位于同一基因簇上，两者分布相同，位于同一基因簇上，两者分布相同，都是都是RDl区编码的。区编码的。ESAT-6和和CFP10能刺激机体产生特异性能刺激机体产生特异性IgG，利用，利用ESAT-6和和CFP10蛋白抗原能及结核分枝杆菌感染者血中特异性蛋白
17、抗原能及结核分枝杆菌感染者血中特异性 IgG结合的结合的特点，采用特点，采用ELISA等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种BCG后所致敏，该方法明显优于后所致敏，该方法明显优于PPD作包被抗原的作包被抗原的ELISA法。法。陈全等以陈全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白为抗原，用融合蛋白为抗原，用ELISA法检测豚鼠血清中抗结法检测豚鼠血清中抗结核分枝杆菌抗体，核分枝杆菌抗体，11份份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11 份份BCG免免疫豚鼠血清仅疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应。份呈阳性反应。15U
18、1蛋白 Mukherjee等收集结核分枝杆菌等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染株静脉感染C57BL/6小鼠早期小鼠早期(1014d)尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到可溶的重组蛋白命名为得到可溶的重组蛋白命名为U1蛋白蛋白(Urine Protein 1)，分子量大约为，分子量大约为16.8kDa。进一步用进一步用ELISA法检测肺结核病人血清中法检测肺结核病人血清中U1抗体的敏感性为抗体的敏感性为60%，检测合并，检测合并HIV感染的结核病患者其敏感性为感染的结核病患者其敏感性为 8
19、7%，而正常人血清不及，而正常人血清不及U1蛋白反应。将蛋白反应。将U1蛋白及蛋白及Mtb81联合用于检测合并联合用于检测合并HIV感染的结核病患者的敏感性为感染的结核病患者的敏感性为93.6%。同时检测了同时检测了12名名HIV感染的非结核病人，其中感染的非结核病人，其中9名患者血清中无可检测的名患者血清中无可检测的U1抗体，抗体，另外另外3名名U1抗体的水平处于抗体的水平处于ELISA法检测的临界点。因此认为，检测法检测的临界点。因此认为，检测U1抗体可抗体可增加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并增加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并HIV感染的结核病患者。感染的结核病患者。16其它抗
20、原 Weldingh等在大肠埃希菌中克隆表达了等在大肠埃希菌中克隆表达了4种超抗原种超抗原TB9.7、TB15.3、TB16.3和和TB51，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为36%93%，而特异性超过，而特异性超过97%，其中，其中TB16.3最为有效，最为有效，TB16.3及及TB9.7联联合检测合并合检测合并HIV感染的结核病患者其敏感性超过感染的结核病患者其敏感性超过85%。Bahk等基因重组表达等基因重组表达Rv3369和和Rv3874两个基因，并用它们做抗原检测结核两个基因，并用它们做抗原检测结核病患者的敏
21、感性分别为病患者的敏感性分别为60%、74%,特异性分别为特异性分别为96%、97%，表明是有价，表明是有价值的结核病血清学诊断抗原。值的结核病血清学诊断抗原。其它抗原，如其它抗原，如MPT64、P90、TB4等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。17摘自：阳幼荣等结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究结核分枝杆菌结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究1819l血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性
22、强的理想抗原。但这方面的应用似乎并血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面的应用似乎并不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有100多年的历史，但至多年的历史，但至今还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。今还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。lWHO对来自不同国家的对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：及痰培养相比，这些种试剂盒产品进行评估，结果表明：及痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为，特异度为5399%1。原因：由于所用的
23、测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。差异较大，并且缺乏可比性。lWHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHO World Health Organization.Diagnosis evaluation series No.2:laboratory-based evalution of 19 commerc
24、ially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.血清学检测血清学检测20结核抗体测定存在的问题结核抗体测定存在的问题1.假阳性假阳性：3%15%。假阳性的发生原因：假阳性的发生原因：1)共同抗原所致的交叉反应；共同抗原所致的交叉反应；2)隐性结核菌感染包括初染、再染、非结核分支杆菌感染、隐性结核菌感染包括初染、再染、非结核分支杆菌感染、卡介苗接种、结核杆菌卡介苗接种、结核杆菌L型感染等，结果均可致结核抗体型感染等，结果均可致结核抗体短期或较长时期的升高；短期或较长时期的升高；3)实验操作实验操作/试剂质量。试剂质量。21
25、2.假阴性假阴性：30%2%。假阴性发生的假阴性发生的原因：原因：1)机体方面所致的假阴性：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为机体方面所致的假阴性：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为阴性，其原因可能及个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产阴性，其原因可能及个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产生少量特异性结核抗体，以致于无法及正常人群的结核抗体水平相区分。生少量特异性结核抗体，以致于无法及正常人群的结核抗体水平相区分。2)特异性免疫复合物的形成：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可及结核抗原特异性免疫复合物的形成
26、：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可及结核抗原结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性。结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性。3)方法方面的因素所致的假阴性：如测定方法本身灵敏度不够、仪器不够灵敏和影响技术方法方面的因素所致的假阴性：如测定方法本身灵敏度不够、仪器不够灵敏和影响技术条件的各种因素均可导致假。条件的各种因素均可导致假。4)试剂质量和操作因素：试剂灵敏度偏低是造成假阴性的主要原因之一，操作人员的业务试剂质量和操作因素：试剂灵敏度偏低是造成假阴性的主要原因之一，操作人员的业务素质也是影响因素之一。素质也是影响因素之一。22WHO不推荐血清学检测方法不推荐血
27、清学检测方法诊断活动性结核病诊断活动性结核病2011年年WHO正式公告：正式公告：由于目前的商由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验结核杆菌的诊断实验1。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.http:/whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_en
28、g.pdf不能早期诊断！容易漏诊、不能早期诊断！容易漏诊、误诊！误诊！232012年年4月月16日，日，SFDA发布了发布了关于进一步加强结核病血液检测试关于进一步加强结核病血液检测试剂监管有关事宜的通知剂监管有关事宜的通知（食药监办械（食药监办械【2012】48号），要求各省、号），要求各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有关结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内关结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内生产结核病诊断血清学制品的企业进行一次背景调查。生产结核病诊断血清学制品
29、的企业进行一次背景调查。分析目前国内核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评分析目前国内核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评价中存在的问题及解决问题的方法。价中存在的问题及解决问题的方法。24我国目前结核病血清学检测试剂的情况 1.我国结核病血清学检测试剂现状我国结核病血清学检测试剂现状 市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒29个，其中经国家个，其中经国家级批准的级批准的26个，省级批准的个，省级批准的1个，进口制品个，
30、进口制品1个。抗原检测试剂盒个。抗原检测试剂盒3个，个，其中省级批准的其中省级批准的1个。个。大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之外，值得引起国家有关部门及人员的关注及重视。外，值得引起国家有关部门及人员的关注及重视。25 2.结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况 调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料、试剂盒成品检测、试剂盒检测调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料、试剂盒成品检测、试剂盒检测参考品制备及标化，参考品使用情况及临床研究等方面；参考品制备及标化，参考品使用情况及临
31、床研究等方面；通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷29份份.我国目前结我国目前结核病血清学诊断制品的品种及近核病血清学诊断制品的品种及近3年的数量见下表年的数量见下表.由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，结果并不由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，结果并不能代表国内实际销售状况。能代表国内实际销售状况。26存在的问题：1.阳性参考品的选择阳性参考品的选择 多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果试剂某
32、批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性试剂某批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度。如血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度。如标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血清用于敏感度的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳清用于敏感度
33、的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳性时。如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性性时。如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性参考品应含有临界阴性参考血清。参考品应含有临界阴性参考血清。27 2.参考品的标化参考品的标化为获得阳性及阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的为获得阳性及阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化
34、，通常以试本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化，通常以试剂盒筛选后就作为检测参考品。剂盒筛选后就作为检测参考品。标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测及标化的过程中所标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测及标化的过程中所有的实验操作均需先制定有的实验操作均需先制定SOP，再，再 严严 格格 遵遵 循循SOP进行操作，并有对应的原进行操作，并有对应的原始记录。从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处始记录。从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处。28 3.参考品的制备参考品的制备结核病体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或结核病
35、体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性及阴性检测参考品。特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性及阴性检测参考品。由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊断试剂的预期用途。原料应及试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样断试剂的预期用途。原料应及试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样可以消除
36、方法基体效应引入的系统误差，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌可以消除方法基体效应引入的系统误差，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参考品。考品。29 4.参考品的稳定性参考品的稳定性参考物质的均一性和稳定性：参考物质的均一性和稳定性：均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和可比性；可比性；稳定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，稳
37、定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次数。数。30临床检验中发现的问题：1.敏感度及特异度虚高敏感度及特异度虚高WHO评
38、估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学诊断）试剂的敏感度和评估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学诊断）试剂的敏感度和特异度变化很大，敏感度变化范围为特异度变化很大，敏感度变化范围为0100%，特异度变化范围为，特异度变化范围为31100%。根据收集的各企业临床资料显示，我国血液诊断试剂的敏感度平均值为根据收集的各企业临床资料显示，我国血液诊断试剂的敏感度平均值为80%左右，高于左右，高于70%的占的占79%；特异度平均值为；特异度平均值为92%，高于，高于90%的占的占95%。2.临床评价仅采用及同类制品进行比较评价的缺陷临床评价仅采用及同类制品进行比较评价的缺陷 部分企部分企 业业 根根
39、据据 体体 外外 诊诊 断断 试试 剂剂 临临 床床 研研 究究 技技 术术 指指 导导 原则原则，“已已有同品种批准上市有同品种批准上市”品的临床研究可采用已批准上市品的临床研究可采用已批准上市质量较好的产品作为质量较好的产品作为对比试剂，进行对比试验研究。对比试剂，进行对比试验研究。3.临床研究的规范性临床研究的规范性 多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕迹明显，这是导致临床研究的特异度及敏感度不真实的主要因素。迹明显，这是导致临床研究的特异度及敏感度不真实的主要因素。3132/45近期结核病诊断方法的
40、相关研究近期结核病诊断方法的相关研究JID 2012:205(Suppl 2),S147.32结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应由于效应T细胞细胞存活时间很短存活时间很短，而且，而且具有特异性具有特异性，因此可以作为机体是否正，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。处于被感染的指标
41、，无论是否有临床症状。基于基于IGRA原理的产品目前已被原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚澳大利亚Cellestis公司的公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英国英国Oxford Immunotec公司的公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:-干扰素释放实验（干扰素释放实验（I
42、GRA)33-干扰素释放实验（干扰素释放实验（IGRA）干扰素干扰素检测阴性检测阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素34T-SPOT.TB原理原理T-SPOT.TB是以拥有专利的特异抗原（是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免），通过酶联免疫斑点技术（疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶早期分泌抗原
43、靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培养滤液蛋白培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）35结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原 由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6及及CFP-10抗原抗原36结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲37酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术结合了细胞培养技术及酶联免疫吸附技术（即结合了细胞培养技术及酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），技术），能够在能够在
44、单细胞水平单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高灵敏度高。38准确准确T-SPOT.TB临床性能指标临床性能指标 特异性特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，及绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)39灵灵 敏敏 度度ReferenceSensitivity Jafari et al 20
45、06 AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3%(21/23)Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9%(70/73)Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Ja
46、nssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9%(26/28)Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8%(80/99)Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(
47、1);168-71*85.7%(36/42)Chee et al J Clin Microbiol.2008 Apr 9*94.1%(254/270)Vincenti et al Clin Exp Immunol.2007 Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2%(34/39)Losi et al Eur Respir J.2007 Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-225910
48、0.0%(22/22)Connell et al PLoS ONE 2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashi et al.Scand J Infect Dis 2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashi et al.J Infect.2008 Epub ahead of print.*90.0%(36/40)Domnguez et al.Diagn Microbiol Infect Dis.2008.*Epub ahead of print84.2%(32/38)Goletti et al.PLoS ONE.2008.3;10:e3417
49、.*89.9%(62/69)Bosshard et al.Respir Med.2008.Epub ahead of print98.4%(62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)40特特 异异 性性41可信可信 T-SPOT.TB国外指南国外指南T-SPOT.TB是采用是采用-干扰素释放试验（干扰素释放试验（IGRA）原理，获得美国）原理，获得美国FDA认证、欧盟认证、欧盟CE认证和中国认证和中国SFDA认证的唯一商业化产品认证的唯一商业化产品列
50、入美国、英国等欧美列入美国、英国等欧美25个国家结核诊疗指南个国家结核诊疗指南 2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、2010年加拿大结核指南美国美国CDC推荐推荐卡介苗（卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选）接种人群结核感染检测首选42各国对潜伏感染风险人群的筛查指南各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群风险人群美国指南美国指南加拿大指南加拿大指南英国指南英国指南免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查TST，如果TST阴性要用IGRA确认TST或IGRABCG接种者（如
