1、临床临床PCR检测的标准化检测的标准化卫生部临床检验中心卫生部临床检验中心 李金明李金明标准化标准化(standardization)的概念的概念nStandard:文字文字nStandards:物质物质nStandardization:通过对测定方法和检测程序的规范化，通过对测定方法和检测程序的规范化，使测定结果的量值可溯源至同一标准物使测定结果的量值可溯源至同一标准物质或参考方法，从而使测定结果在不同质或参考方法，从而使测定结果在不同方法、不同试剂及不同的实验间具有可方法、不同试剂及不同的实验间具有可比性。比性。标准物质、测定方法和检测程标准物质、测定方法和检测程序标准化之间的关系序标准化
2、之间的关系为什么要进行标准化为什么要进行标准化?n通过标准化以改善实验室测定的准确度，通过标准化以改善实验室测定的准确度，从而提高不同的实验室间结果的可比性。从而提高不同的实验室间结果的可比性。n缺乏标准化，则不同试剂、不同方法、缺乏标准化，则不同试剂、不同方法、不同实验室间的测定结果就无法一致，不同实验室间的测定结果就无法一致，没有可比性，也无法对一种方法、一种没有可比性，也无法对一种方法、一种试剂进行适当的评价。试剂进行适当的评价。标准化的先决条件标准化的先决条件n检测物的同一性检测物的同一性n标准品的同一性标准品的同一性标准化组织标准化组织n世界卫生组织（世界卫生组织（WHO）生物学标准
3、化专家委员会（生物学标准化专家委员会（The Expert Committee on Biological Standardisation,ECBS）：）：负责建立生负责建立生物物质的国际标准及参比材料。物物质的国际标准及参比材料。n国家生物学标准和质控物研究所（国家生物学标准和质控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC）：）：WHO通过其提供通过其提供国际标准品。国际标准品。n一些区域和地区性组织一些区域和地区性组织：美国：美国CDC、CAP、NIHn国际性科学协会：国际性科学协会：IFCC、国家临
4、床实验室标准化委员会国家临床实验室标准化委员会（National Committee of Clinical Laboratory Standardisation,NCCLS）以及美国和加拿大临床化学协会以及美国和加拿大临床化学协会（American Societies for Clinical Chemistry and Canadian Societies for Clinical Chemistry and Canadian,AACC 和和CSCC）等：组织编写一些临床检验的导则等文件等：组织编写一些临床检验的导则等文件 标准品和质控品（标准品和质控品（1 1）n可提供标准品的国际标准化
5、组织有：可提供标准品的国际标准化组织有：WHO生物学标准化专家委员会生物学标准化专家委员会（ECBS）、）、英国国家生物学标准和质控英国国家生物学标准和质控物研究所物研究所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)、美国美国CDC和和CAP、国国家卫生研究所（家卫生研究所（NIH）、）、IFCC等；国内等；国内有中国药品生物制品检定所、卫生部临有中国药品生物制品检定所、卫生部临床检验中心床检验中心标准品和质控品标准品和质控品（2 2）n在美国临床在美国临床PCR检验试剂方法用于临床检验试剂方法用于临床必须有必须
6、有FDA批准；在德国监督机构为批准；在德国监督机构为INSTAND；在国内试剂批准文号由在国内试剂批准文号由SFDA负责。负责。n仅使用标准品并不能保证仅使用标准品并不能保证PCR测定结果测定结果的可比性，但其在保证的可比性，但其在保证PCR测定质量中测定质量中的重要性却是不可替代的的重要性却是不可替代的。标准品和质控品（标准品和质控品（3 3）n标准品和质控品的功能标准品和质控品的功能:可用作临床检测的校可用作临床检测的校准物准物;可用来评价试验的有效性可用来评价试验的有效性;作为室内质作为室内质控样本控样本;作为室间质评样本作为室间质评样本.n国际标准品分级国际标准品分级:可分为第一可分为
7、第一,第二和第三等三第二和第三等三个等级个等级.一级标准数量有限一级标准数量有限,可使用可使用10-2010-20年年,是冻干品是冻干品,内含载体蛋白内含载体蛋白.一级标准可用来校一级标准可用来校准第二和第三级标准准第二和第三级标准.国际标准品国际标准品(IS)(IS)中作为中作为第一级标准第一级标准,二级标准可用来维持校准二级标准可用来维持校准.n国内标准品分级：一级和二级。国内标准品分级：一级和二级。标准品和质控品（标准品和质控品（4 4）n标准品的单位标准品的单位:病毒核酸国际标准品均病毒核酸国际标准品均以以IU/L表示表示。有关标准品单位和溯源的问题有关标准品单位和溯源的问题n长度单位
8、的确定和溯源举例标准品定值的测定方法标准品定值的测定方法 :参考方法参考方法n决定性方法（决定性方法（Definitive method）:是一个具是一个具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。有高精密度及没有系统偏差的参考方法。n参考方法参考方法:(Reference method）:应有低测定下应有低测定下限、不受非特异干扰及不与相关的化合物发生限、不受非特异干扰及不与相关的化合物发生交叉反应，同时还应该容易得到。交叉反应，同时还应该容易得到。n为保持参考方法的有效性为保持参考方法的有效性,有必要建立一个参有必要建立一个参考实验室的网络考实验室的网络.国际单位国际单位(Internation
9、al Units)International Units)的的由来由来n国际单位（国际单位（International units,IU）定义定义:国际标准的应用目的是为测定提供一个通国际标准的应用目的是为测定提供一个通用的标准单位用的标准单位,使用相同的测定生物学单使用相同的测定生物学单位来指定标准品或工作校准品的单位位来指定标准品或工作校准品的单位.核酸检测国际标准核酸检测国际标准 项目 研制者 发布年 编号 浓度HBV DNA NIBSC 1999 97/746 106 IU/mlHCV RNA NIBSC 1997 96/790 105 IU/ml NIBSC 2005 96/798
10、105 IU/mlHIV-1 RNA NIBSC 1998 97/656 105 IU/瓶HAV RNA NIBSC 2003 00/560 105 IU/mlB19 DNA NIBSC 2000 99/800 106 IU/ml病毒核酸检测国家标准病毒核酸检测国家标准 项项 目目 研制者研制者 发布年发布年 编编 号号 浓浓 度度HBV DNA NCCL 2005 GBW(E)090031 1.03106 IU/ml NCCL 2007 GBW09151HCV RNA NCCL 2005 GBW(E)090032 1.29105 IU/ml NCCL 2007 GBW09152测定方法的标准
11、化测定方法的标准化 n一个测定方法的组成一个测定方法的组成 （1）核酸提取方法；（2）扩增及产物分析方法；（3）如果靶核酸，还有反转录过程。核酸提取方法核酸提取方法 n对抑制物去除的有效性；n简便性。扩增及产物分析方法扩增及产物分析方法 n实时荧光PCRnPCR-ELISA等。n扩增检测条件（循环条件、试剂等）的理想化。n内标的设置：假阴性质控的最有效的方法n反转录试剂的效率。工作程序的标准化工作程序的标准化n标本采集程序的标准化n仪器设备的校准、维护和正确使用n试剂和消耗品的质检n防“污染”措施的实施n人员的培训上岗n严格的室内质量控制n参加室间质量评价n结果报告和解释的标准化n工作规范的制订
