1、基基 因因 诊诊 断断Gene Diagnosis 1.实验室诊断技术实验室诊断技术第一类实验室诊断技术第一类实验室诊断技术 以细胞学检查为主，根据疾病所导致的细胞形态或以细胞学检查为主，根据疾病所导致的细胞形态或/和数量的改变提供诊断依据和数量的改变提供诊断依据第二类实验室诊断技术第二类实验室诊断技术 通过分析代谢产物和酶的活性变化为诊断提供信息通过分析代谢产物和酶的活性变化为诊断提供信息第三类实验室诊断技术第三类实验室诊断技术 以免疫学检查技术为主，通过识别特定蛋白质分子以免疫学检查技术为主，通过识别特定蛋白质分子的差异为诊断提供依据的差异为诊断提供依据基因诊断技术基因诊断技术2.1978
2、年，美国科学院院士美籍华裔科学家年，美国科学院院士美籍华裔科学家Kan（简悦威（简悦威）和和Dozy应用液相应用液相DNA分子杂分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断，交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。标志着检验诊断进入基因诊断时代。3.Southern吸附法吸附法 4.基基 因因 致致 病病内源基因的变异内源基因的变异 人自身基因的结构或表达异常导致多种疾病人自身基因的结构或表达异常导致多种疾病 （遗传性疾病、肿瘤、心血管病、糖尿病等）（遗传性疾病、肿瘤、心血管病、糖尿病等）外源基因的入侵外源基因的入侵 （感染性疾病）感染性疾病）5.基因诊断的定义
3、与特点基因诊断的定义与特点定义：定义：利用分子生物学技术，从利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。异和表达状态，从而对疾病作出诊断。6.特点：特点：1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强 2.应用应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少 3.可以检测患病者，和致病基因携带者可以检测患病者，和致病基因携带者 4.在疾病尚无临床症状时作出早期诊断在疾病尚无临床症状时作出早期诊断 5.检测样品获取方便，不受组织
4、或时相限制检测样品获取方便，不受组织或时相限制 6.检测对象可以是自体基因或外源基因，适用于多种疾病的诊断检测对象可以是自体基因或外源基因，适用于多种疾病的诊断7.基因诊断的三个层次基因诊断的三个层次 基因诊断的基本方法基因诊断的基本方法 用什么技术去诊断用什么技术去诊断基因诊断的目标基因诊断的目标 检测遗传物质发生了什么变化检测遗传物质发生了什么变化基因诊断的结论基因诊断的结论 确定得了什么病确定得了什么病8.第一层次：基因诊断的基本方法第一层次：基因诊断的基本方法（用什么技术去诊断）（用什么技术去诊断）一、一、核酸分子杂交核酸分子杂交 原理：原理：核酸的变性复性理论。核酸的变性复性理论。双
5、链的核酸分子在某些理化因素（如高温等）双链的核酸分子在某些理化因素（如高温等）作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同来源的来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补配）分子，只要具有部分互补配对的碱基序列，即可形成杂合双链对的碱基序列，即可形成杂合双链。核酸印迹杂交：核酸印迹杂交：Southern blot,Northern blot斑点印迹杂交（斑点印迹杂交（Dot blot）原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）基因芯片（基因芯片（g
6、ene chip）9.探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结果检测结果检测探针探针（probe）用放射性核素或其他标用放射性核素或其他标记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷酸），它具有特定的序列，能够与待测的核酸），它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中的特定品中的特定DNA或或RNA。种类：种类：DNA,RNA,寡核苷酸寡核苷酸标记物：标记物：放射性核素，生物素，地高辛，荧光素放射性核素，生物素，地高辛，荧光素制备方法制备方法:(1)化学法化学
7、法 (2)酶促法：酶促法：末端标记；切口平移法；随机引物法末端标记；切口平移法；随机引物法10.电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结果检测结果检测探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备组织中提取组织中提取：基因组基因组DNA/DNA/限制性内切酶消化限制性内切酶消化 细胞总细胞总RNARNA基因文库基因文库核酸混合物核酸混合物11.电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结果检测结果检测探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备待测样品按照分子量大小分离待测样品按照分子量大小分离分子量分子量markerDNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳RNA、蛋白质等、蛋白质等 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1
8、2.电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结果检测结果检测探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备印渍技术：印渍技术：将存在于凝胶中的生物大分子转移到将存在于凝胶中的生物大分子转移到固定化介质上并加以分析的技术。用于固定化介质上并加以分析的技术。用于DNA、RNA、蛋白质的检测。、蛋白质的检测。硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC膜）膜）尼龙膜尼龙膜PVDF膜等膜等(1)DNA印渍技术：印渍技术：Southern Blotting(2)RNA印渍技术：印渍技术：Northern Blotting(3)蛋白质印渍技术：蛋白质印渍技术：Western Blotting13.电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结
9、果检测结果检测探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备预杂交预杂交杂交杂交洗膜洗膜封闭样品中非特异性的结合位点封闭样品中非特异性的结合位点鲑精鲑精DNA、脱脂奶粉、脱脂奶粉将探针溶于杂交缓冲液将探针溶于杂交缓冲液膜浸于其中进行杂交膜浸于其中进行杂交缓冲液洗涤去除未杂交探针缓冲液洗涤去除未杂交探针14.电泳分离电泳分离转膜转膜杂交杂交结果检测结果检测探针的制备探针的制备样品的制备样品的制备同位素同位素 放射自显影放射自显影荧光、化学发光荧光、化学发光 压压X光片光片生物素生物素 酶标亲和素酶标亲和素底物显色底物显色地高辛地高辛 酶标抗体酶标抗体底物显色底物显色15.16.点杂交点杂交（dot b
10、lot）将将RNA或或DNA变性后直接点样于膜上，变性后直接点样于膜上，再采用特定的探针进行杂交。再采用特定的探针进行杂交。17.原位杂交原位杂交（in situ hybridization）菌落原位杂交菌落原位杂交 用于基因克隆和基因文库的筛选用于基因克隆和基因文库的筛选组织细胞原位杂交组织细胞原位杂交 确定特定核酸序列在染色体上的定位；确定特定核酸序列在染色体上的定位；组织细胞组织细胞中特定基因的表达水平（即相应中特定基因的表达水平（即相应mRNA的水平）的水平）18.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele specific oligonucleotid
11、e hybridization,ASOH）如果基因的某一位点发生了突变，那么如果基因的某一位点发生了突变，那么根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计并合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因并合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因的碱基序列互补（的碱基序列互补（M M），另一种与正常基因，另一种与正常基因在相应位点上的核苷酸序列互补（在相应位点上的核苷酸序列互补（N N），通过），通过杂交即可杂交即可确定待检的确定待检的2 2个等位基因是否有一个个等位基因是否有一个或全部发生了突变或全部发生了突变。19.杂交杂交正常正常 突变突变 突变突变 杂合子杂合子 纯合子
12、纯合子正常正常 突变突变 突变突变 杂合子杂合子 纯合子纯合子MNMN20.基因芯片基因芯片(gene chip,gene microarray)生物芯片生物芯片 DNA芯片、蛋白质芯片、组织芯片芯片、蛋白质芯片、组织芯片基因芯片技术基因芯片技术 (一种高通量的固相核酸杂交技术一种高通量的固相核酸杂交技术)将大量预先合成的将大量预先合成的DNADNA探针以显微打印的方式有探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信息（基因序列和表达信息）。由
13、于常用计算机硅芯息（基因序列和表达信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，故名基因芯片。片作为固相支持物，故名基因芯片。21.Cy3标记病变细胞标记病变细胞cDNA Cy5标记正常细胞标记正常细胞cDNA 两图叠加分析两图叠加分析 （红色）（红色）（绿色）（绿色）应用基因芯片筛选差异表达基因应用基因芯片筛选差异表达基因22.第一层次：基因诊断的基本方法第一层次：基因诊断的基本方法（用什么技术去诊断）（用什么技术去诊断）二二.聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)u 组分：组分：DNA模板模板 合成原料：合成原料：dNTP 引物：一对引物：一对
14、高温高温DNA聚合酶：聚合酶：Taq酶酶 缓冲液：含缓冲液：含Mg2+H2Ou 反应过程：反应过程：（20-35个循环）个循环）变性：变性：95 10-45s退火：退火：55-65 10-30s延伸延伸:72 30-60s23.35533535353535353555555333332n2n24.355335353535353535555553333325.PCR的衍生类型：的衍生类型：1.反转录反转录PCR 2.原位原位PCR 3.重组重组PCR 4.不对称不对称PCR 5.多重多重PCR 6.反向反向PCR 7.锚定锚定PCR 8.巢式巢式PCRPCRPCR26.第一层次：基因诊断的基本方
15、法第一层次：基因诊断的基本方法（用什么技术去诊断）（用什么技术去诊断）三、三、DNA序列测定序列测定27.28.第一层次：基因诊断的基本方法第一层次：基因诊断的基本方法（用什么技术去诊断）（用什么技术去诊断）四四、其他方法、其他方法 限制性内切酶酶谱分析限制性内切酶酶谱分析 一种检测特定位点基因突变的方法。当基因的突一种检测特定位点基因突变的方法。当基因的突变发生在某种限制性内切酶的识别位点时，用该限变发生在某种限制性内切酶的识别位点时，用该限制性内切酶消化该突变基因，并用探针通过核酸杂制性内切酶消化该突变基因，并用探针通过核酸杂交检测消化后的片段，将检测到与野生型基因消化交检测消化后的片段，
16、将检测到与野生型基因消化产物不同的片段组合，从而确定产物不同的片段组合，从而确定2 2个等位基因之一或个等位基因之一或全部是否发生了某种突变。全部是否发生了某种突变。29.gagttc ggatccctcaag cctagggaattc ggatcccttaag cctagg 0.8kb1.5kb1.2kbGGATCCCCTAGGBamHGAATTCCTTAAGEcoR2.3kb1.5kb1.2kb0.8kb正常正常 携带者携带者 患者患者30.l DNA多态性分析多态性分析 限制性酶切片段长度多态性（限制性酶切片段长度多态性（RFLP）：在在人类基因组人类基因组DNA中存在大量的核苷酸突变，
17、当突变发生在中存在大量的核苷酸突变，当突变发生在限制性核酸内切酶的识别位点上时，如果用相应的限制性限制性核酸内切酶的识别位点上时，如果用相应的限制性内切酶切割该内切酶切割该DNA，产物进行电泳就会产生长度和数目不，产物进行电泳就会产生长度和数目不同的片段，称为限制性片段长度多态性同的片段，称为限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)。单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）：单个或多个碱基突单个或多个碱基突变可能影响单链核酸分子的构象，从而在非变性凝胶电泳变可能影响单链核酸分子的构象，从而在非变性凝胶电泳时表现出不同的
18、迁移率，以此来检测核酸序列中的点突时表现出不同的迁移率，以此来检测核酸序列中的点突变变。目前还没有确切的理论预测碱基突变、构象改变与电目前还没有确切的理论预测碱基突变、构象改变与电泳迁移率三者的定量关系，因而泳迁移率三者的定量关系，因而SSCP仍然是经验技术。仍然是经验技术。31.串联重复序列多态性串联重复序列多态性:人基因组的非编码区存在大人基因组的非编码区存在大量的串联重复序列，其中有些是以一系列短的重复序列排量的串联重复序列，其中有些是以一系列短的重复序列排列组成的高变区，称为数量可变的串联重复序列列组成的高变区，称为数量可变的串联重复序列(VNTR)。在一些遗传病和多种肿瘤中都观察到重
19、复序列的增加或丢在一些遗传病和多种肿瘤中都观察到重复序列的增加或丢失。对这种串联重复序列的多态性进行分析，可用于疾病失。对这种串联重复序列的多态性进行分析，可用于疾病的诊断。具体方法是：针对串联重复序列两侧的的诊断。具体方法是：针对串联重复序列两侧的DNA序列序列设计引物，用设计引物，用PCR扩增出这段重复序列，然后用凝胶电泳扩增出这段重复序列，然后用凝胶电泳对扩增出的序列进行长度分析。对扩增出的序列进行长度分析。单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SNP)32.第二层次：诊断的目标第二层次：诊断的目标(检测遗传物质发生了什么变化检测遗传物质发生了什么变化)检测基因水平（有或无，量多少）、结构的变化
20、检测基因水平（有或无，量多少）、结构的变化 点突变点突变:PCR/ASOH PCR/SSCPPCR33.杂交杂交正常正常 突变突变 突变突变 杂合子杂合子 纯合子纯合子正常正常 突变突变 突变突变 杂合子杂合子 纯合子纯合子MNMNPCR/ASOH(等位基因特异的寡核苷酸探针杂交等位基因特异的寡核苷酸探针杂交)34.不对称不对称PCR电泳电泳 Marker 正常正常 突变突变PCR/SSCP(单链构象多态性单链构象多态性)35.大片段核酸片段的丢失或插入大片段核酸片段的丢失或插入:多重多重PCR多重多重PCR Marker 正常正常 缺失缺失36.基因重排检测基因重排检测:荧光原位杂交技术（荧
21、光原位杂交技术（FISH）基因扩增基因扩增:Southern 结合条带密度扫描结合条带密度扫描 基因表达异常基因表达异常 mRNA定性分析：定性分析：Northern Blotting mRNA 定量分析：反转录定量分析：反转录PCR 结合放射自显影和结合放射自显影和 密度扫描，或放射性活度测定密度扫描，或放射性活度测定 外源基因的侵入外源基因的侵入:PCR 37.第三层次：诊断结论第三层次：诊断结论(检测得了什么病检测得了什么病)遗传病遗传病 检测待检者细胞内是否存在可能导致遗传性检测待检者细胞内是否存在可能导致遗传性疾病的基因突变或缺失（表现为基因单个或多个疾病的基因突变或缺失（表现为基因
22、单个或多个核苷酸位点的突变，或大片段核苷酸的丢失）。核苷酸位点的突变，或大片段核苷酸的丢失）。检测对象为一般患者或胎儿（产前诊断）检测对象为一般患者或胎儿（产前诊断）(血红蛋白病、苯酮尿症等血红蛋白病、苯酮尿症等)38.感染性疾病感染性疾病 通过检测病原体的基因确定待检者体内是否通过检测病原体的基因确定待检者体内是否存在正在生长的或处于潜伏状态的病原体存在正在生长的或处于潜伏状态的病原体 ，以及，以及对病原体分型，用以研究病原体遗传变异趋势对病原体分型，用以研究病原体遗传变异趋势流行病学和预防医学流行病学和预防医学 （乙肝病毒、（乙肝病毒、HIVHIV、痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌）、痢疾杆菌和侵
23、袭性大肠杆菌）39.例例:艾滋病的临床检测艾滋病的临床检测 PCR PCR检测检测HIV RNAHIV RNA基因组的存在基因组的存在组织（如血液）中总组织（如血液）中总RNARNA提取提取反转录成反转录成cDNAcDNA利用利用HIVHIV特异性引物进行特异性引物进行 PCR PCR电泳检测预期条带的出现电泳检测预期条带的出现600 bpRNAcDNARNAcDNA40.肿瘤肿瘤 通过从基因水平检测细胞内可能导致肿瘤发通过从基因水平检测细胞内可能导致肿瘤发生的基因突变、扩增、重排、缺失，或生的基因突变、扩增、重排、缺失，或mRNAmRNA水平水平检测肿瘤细胞中特异表达的基因或基因表达量的检测肿瘤细胞中特异表达的基因或基因表达量的改变，对肿瘤进行早期诊断，并对肿瘤进行分类、改变，对肿瘤进行早期诊断，并对肿瘤进行分类、预后判断。预后判断。41.重大疾病的易感性重大疾病的易感性 检测人类白细胞抗原基因等与疾病的易感性相关检测人类白细胞抗原基因等与疾病的易感性相关的基因的基因 器官移植组织配型器官移植组织配型法医学法医学 (个体识别、亲子鉴定、法医物证个体识别、亲子鉴定、法医物证)DNA 指纹指纹：（：（1）RFLP（2）串联重复序列）串联重复序列42.43.
