1、纯化清洁验证纯化清洁验证 目录目录u 清洁验证的定义u 法规对清洁验证的要求u 清洁验证的前提u 设备分组u 待清洁成分u 可接受限度u 取样方法u 取样点的选择u 检验方法u 特殊设备的清洁验证u 再验证u 偏差与变更控制u 案例分析清洁验证的定义清洁验证的定义u清洗验证是用书面证据证明批准的清洗规程可以对设备进行有效的清洗，并使清洗后的设备适用于产品的制造或包装，即设备内表面的残留物及微生物指标达到清洁要求所规定的标准。u通常清洁验证应包括以下三个方面：1、生产结束至开始清洁的最长时间（也称待清洁时限）；2、已清洁设备用于下次生产前的最长存放时间（也称清洁效期）；3、连续生产最长时间（阶段
2、性生产，大小清场）。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求u中国GMP的要求（2010年版）第一百四十三条清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求uGMP附件 确认与验证第三十八条 为确认与产品直接接触设备的清洁操作规程的有效性，应当进行清洁验证。应当根据所涉及的物料，合理地确定活性物质残留、清洁剂和微生物污染的限度标准。第三十九条 在清洁验证中，不能采用反复清洗至清洁的方法。目视检查
3、是一个很重要的标准，但通常不能作为单一可接受标准使用。第四十条 清洁验证的次数应当根据风险评估确定，通常应当至少进行连续三次。清洁验证计划完成需要一定的时间，验证过程中每个批次后的清洁效果需及时进行确认。必要时，企业在清洁验证后应当对设备的清洁效果进行持续确认。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求uGMP附件 确认与验证第四十一条 验证应当考虑清洁方法的自动化程度。当采用自动化清洁方法时，应当对所用清洁设备设定的正常操作范围进行验证；当使用人工清洁程序时，应当评估影响清洁效果的各种因素，如操作人员、清洁规程详细程度（如淋洗时间等），对于人工操作而言，如果明确了可变因素，在清洁验证过程中应当
4、考虑相应的最差条件。第四十二条 活性物质残留限度标准应当基于毒理试验数据或毒理学文献资料的评估建立。如使用清洁剂，其去除方法及残留量应当进行确认。可接受标准应当考虑工艺设备链中多个设备潜在的累积效应。第四十三条 应当在清洁验证过程中对潜在的微生物污染进行评价，如需要，还应当评价细菌内毒素污染。应当考虑设备使用后至清洁前的间隔时间以及设备清洁后的保存时限对清洁验证的影响。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求uGMP附件 确认与验证第四十四条 当采用阶段性生产组织方式时，应当综合考虑阶段性生产的最长时间和最大批次数量，以作为清洁验证的评价依据。第四十五条 当采用最差条件产品的方法进行清洁验证模
5、式时，应当对最差条件产品的选择依据进行评价，当生产线引入新产品时，需再次进行评价。如多用途设备没有单一的最差条件产品时，最差条件的确定应当考虑产品毒性、允许日接触剂量和溶解度等。每个使用的清洁方法都应当进行最差条件验证。在同一个工艺步骤中，使用多台同型设备生产，企业可在评估后选择有代表性的设备进行清洁验证。第四十六条 清洁验证方案应当详细描述取样的位置、所选取的取样位置的理由以及可接受标准。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求uGMP附件 确认与验证第四十七条 应当采用擦拭取样和（或）对清洁最后阶段的淋洗液取样，或者根据取样位置确定的其他取样方法取样。擦拭用的材料不应当对结果有影响。如果采
6、用淋洗的方法，应当在清洁程序的最后淋洗时进行取样。企业应当评估取样的方法有效性。第四十八条 对于处于研发阶段的药物或不经常生产的产品，可采用每批生产后确认清洁效果的方式替代清洁验证。每批生产后的清洁确认应当根据本附录的相关要求进行。第四十九条 如无法采用清洁验证的方式来评价设备清洁效果，则产品应当采用专用设备生产。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求u欧盟GMP的要求 36.为确认清洁规程的效力，应进行清洁验证。应根据所涉及的物料，合理的确认产品残留、清洁剂和微生物污染的限度标准。这个限度标准应该是可以达到的，能够证实的。37.应使用经验证的、检出灵敏度高的检验方法来检测残留或污染物。每种
7、分析方法或仪器的检测灵敏度应足以检测出设定合格限度水平的残留或污染物。38.通常只有接触产品设备表面的清洁规程需要验证。某些场合下，还应考虑不直接接触产品的部分。应验证设备使用与清洁的间隔时间，以及已清洁设备可保留的时间，并通过验证确定清洁的间隔时间和清洁方法。法规对清洁验证的要求法规对清洁验证的要求u欧盟GMP的要求 39.对于相似产品和相似工艺而言，可从相似产品及工艺中，选择一个具有代表性的产品和工艺进行清洁验证。可采用“最差条件”的方法进行单独的验证试验，在验证中应考虑关键因素。40.为证明方法是经过验证的，通常应在3个连续批上使用该清洁规程，并检验合格。41.清洁验证不应采用“不断测试
8、，直至清洁”的方式。42.如果实际产品是有毒物质或有害物质，在清洁验证中，可以例外地采用物化特性相似的无毒无害物质来模拟。清洁验证的前提清洁验证的前提u 厂房、设备、公用系统（水电汽等）经过验证（至少含IQ/OQ）。设备在运行确认中，已通过核黄素试验、风险评估或其他方法确认最难清洁部位。u 生产工艺流程已经确认。u 清洁规程已经确定，明确四个重要参数TACT，即清洗时间、清洗动作要求，清洗液浓度，清洗液温度。有完善的操作说明书。u 相关记录已放到现场（操作记录、取样记录）。u 分析方法和检验仪器经过验证。（专属性，灵敏度，精密度，线性范围，检验回收率）u 取样方法经过验证。取样回收率。对于极易
9、溶于水的残留，如作为清洁剂的氢氧化钠，因为其溶度远低于其溶解度，可不必进行回收率的研究。根据PDA TR49，清洁验证并不要求对生物负载与内毒素回收率进行研究。u 物料试剂经过检验合格。u 操作人员经过培训，并获得相应资质。u 完成实验性工作。设备分组设备分组u 设备分组可以筛选验证对象，降低不必要和无价值的验证工作，使验证更有针对性。u 设备分组应考虑是否接触产品活性成分，是否多产品共用，设备是否反复使用，设备清洁方法（手工清洗、自动清洗），设备材质，设备结构，设备规格。u 设备分组的策略是基于设备应在设计和可清洁性上“相同”或“相似”，“相同”或“相似”的理由，应在验证方案中予以清晰的描述
10、。待清洁成分设备分组设备分组示例：u 直接接触产品活性成分，多品种共用的设备。验证的重点。可以选择最难清洁的产品进行重点验证，其他产品进行简单确认。u 直接接触产品活性成分，品种专用的设备。u 不接触产品活性成分的设备，如接触缓冲溶液、辅料的设备。u 一次性使用的设备。该类设备不需要清洁验证。二次分组：按照设备材质、设备结构和清洗方法进行二次分组，对于材质、结构一致，且清洗方法一样的设备，可以选择规格最大和规格最小的设备进行验证，对于其余规格的设备最好也进行一次简单的确认。设备分组设备分组u 根据风险分析结果，结合设备选型设计的比对，将化学因素和物理因素进行成组比对，选择代表性的组合进行验证，
11、并使用最差条件进行模拟。待清洁成分设备分组设备分组u设备分组验证策略u 当设备相同时，可以设计一个检测矩阵，每次检测时抽取几个设备，合计完成本次全部项目的检测，共验证至少3次，验证结束后每台设备至少有1个项目被检测1次。只要给出充分的理由说明设备的项目是“相同”的，就没有必要对该组中每个设备的每个项目都验证一次。为了便于管理，也可以抽取其中3台设备，分别进行一次完整的检测，其他设备各抽检一次，只抽检个别项目。u 对于“相似”的设备，要选取最差情况的设备为代表，或者对设备进行归类。例如，在容积相同但构造不同的储液罐中，选择构造更复杂的设备作为最差情况。在构造相似但容积不同的储液罐中，选择最大和最
12、小的（代表极端情形）来进行正式的验证运行（除非某个容积可以认定为最差情况）。对该组中的其它设备（不是最差情形）选择确认运行（至少一个批次）。待清洁成分待清洁成分待清洁成分u 在清洁验证中，为所有待清洁成分都制定限度标准并一一检测是不切实且没有必要的。在一定的意义上，清洁的过程是个溶解的过程，因此，通常的做法是从各组分中确定最难清洁（溶解）的物质，以此作为参照物质，或者根据待清洁成分的共有特性，选择一个指标进行确认。u 待清洁成分可分为活性成分、工艺相关杂质、辅料、清洁剂、微生物（来自物料、清洁过程、环境）。活性成分可能包含产品相关杂质，如聚合体，降解物等。不同生产阶段可能含有不同的工艺相关杂质
13、。比如发酵阶段含工程菌及细胞碎片等，在纯化阶段含细菌内毒素、菌体蛋白、外源DNA等。清洁剂最常用的是氢氧化钠溶液，可能还有酸、表面活性剂等。u 示例示例待清洁成分待清洁成分待清洁成分待清洁成分u 最难参照物的选择u 单组分产品：组份=参照物原料药直接分装n多种成份一般原则n最难参照物选择考虑因素清洁能力药物活性成分和辅料的水溶性残留影响导致的风险功能分类毒性n如最难清洁物质非单一物质，则将一起作为最难清洁物质。可接受限度可接受限度u 清洁验证方案中最关键的技术问题为如何确定可接受限度。选择产物残留、清洁剂、微生物污染，以及其他任何工艺成分的限度，逻辑上应该基于物料对生产流程和产品的安全性和纯度
14、的影响而定。可接受限度通常由企业自己确定。确定的可接受限度应该具有“实用性、易获取性、可验证性”。u 对于不同的生产阶段，可接受限度可以有所区别，比如前期阶段，如发酵、纯化，由于后面还有纯化步骤，因此其清洁标准可适当放宽。u 计算设备内表面积不能只考虑单个设备，而应考虑产品生产过程中所接触的整个设备链的面积，过高估计设备表面积是保险的做法。可接受限度可接受限度u活性物质限度u清洁剂限度u微生物限度u内毒素限度u视觉清洁标准可接受限度可接受限度u活性物质限度：u 10ppm：上批产品残留在设备里的物质全部溶解到下批产品中的浓度限度不超过10ppm（百万分之十）。u1ppm=1mg/kg=1mg/
15、L=110-6u 1/1000 MinTD：上批产品残留在下批产品的活性成分不得高于最低日治疗剂量的千分之一。可接受限度可接受限度u活性物质限度u 纯化层析工艺具有选择性，残留的活性蛋白难以在工艺步骤中逐步向下传递。在清洁剂的作用下，残留的活性蛋白也容易被分解。因此用于制剂生产阶段的MAC计算通常不适用于原液的生产。u 参考PDA TR49指南中的规定，可以选择使用一些限制区域的表面积计算残留量，例如使用最后一步纯化工艺后的所有生产设备。u 根据相关清洁验证指南的推荐，原液生产阶段，可接受标准通常为下游工艺TOC 1-2ppm和上游工艺TOC 5-10ppm。对于如超滤膜和色谱填料这些产品专用
16、材料可以更高。可接受限度可接受限度uMACMAC计算公式计算公式u MAC：Maximum Allowable Carryover，最大允许残留量。u MinTD：已清洁的产品的活性物质的最小日治疗剂量。u MBS：使用同一设备生产的下一产品的活性物质的最小批量。u MaxDD：使用同一设备生产的下一产品的活性物质的最大日剂量。u SF：安全因子。SF=1000。MinTDMBSMAC=SFMaxDD可接受限度可接受限度nTOC与蛋白值的关系通常清洁验证采用TOC作为分析方法，TOC的定量限度大约为100500ppb碳，与含碳量为50%的约2001000ppb蛋白质的数值等效（基于生物制品）可
17、接受限度可接受限度u清洁剂限度：u 我司的清洁剂成分包括：NaOH、NaCl和水。其中NaCl和水是人体的正常成分，毒性可以忽略。u 通常的做法是用电导率的值为其设定间接的限度。氢氧化钠的可接受水平建立在毒理学的残留量计算或者是工艺参数的效果之上。因此，限度是基于注射用水的标准或者是稍高于这个标准（例如5 S/cm）。u 基于市售化学试剂的毒性计算是比较极端的，因为氢氧化钠并不会以氢氧化钠的形式污染到最终的产品中。如果这些化学物质以高浓度完整地污染下来，通过工艺检查（这样会引起PH的显著变化）也会发现这种不符合性。u 因此，目标并不要求与注射用水的标准一致，而是确认一个很低的清洁剂含量。而允许
18、电导率限度略高于注射用水限度的原因是，注射用水的限度要求只是适用于管路中的循环注射用水。一旦从循环管路中取出来并通过清洁设备（尤其是通过喷淋装置时它可以从空气中摄取二氧化塔），不要期望它一定会满足WFI的电导率限度。可接受限度可接受限度u 清洁剂限度：u 阅毒理学数据库（http:toxnet.nlm.nih.gov，美国），NaOH的LD50为40 mg/kg（mouse，ip.），具有较高的安全阈值。假设NaOH对于人的LD50和小鼠一致，按照成人体重为60kg计，则需要注射2.4g NaOH才能达到半致死剂量。u 检测清洁剂残留常用方法为电导率和pH。根据测试结果，25s/cm（25）时
19、的NaOH浓度约为5.5g/ml。计算可得，pH为8（25）时，NaOH浓度为10-6mol/L（折合为0.04g/ml）。在电导率为25s/cm（25）或pH为8时，每支制剂产品中的NaOH残留量最大为9.35g（rhG-CSF 480g/支的装量为1.7ml/支），远低于半致死剂量的千分之一。可接受限度可接受限度n微生物限度n不要预期清洁过程会导致设备的无菌结果。n即使设备将进行在线灭菌或者是在下一产品生产前灭菌，通常的做法是评估微生物负载来确保随后的生产工艺不会被过度挑战。n只要达到一般的非无菌生产微生物限度标准（1-2CFU/cm2表面取样方法）就已经是足够的。n对于冲洗取样，一些公司
20、将利用典型WFI的值（10 CFU/100毫升），而其他公司将利用100 CFU/100毫升或1,000 CFU/100毫升的值。设定较高的限度原因是随后设备将进行灭菌。n制定方法n下批产品原料及生产过程既不增加微生物繁殖，也不会减少微生物繁殖n下批产品生产前设备在生产前不灭菌，但产品最终灭菌n下批产品生产前设备在生产前需要灭菌可接受限度可接受限度n微生物限度n下批产品生产前设备在生产前不灭菌，但产品最终灭菌，其微生物限度设定方法以灭菌前微生物含量限度为基础进行计算n产品的无菌保证值的大小与灭菌前工艺的F0值以及灭菌前微生物的含量有关，因此任何一个经过验证的灭菌工艺都需要确定允许的灭菌前微生物
21、的限度，知晓这个限度后，后面的计算与第一种情况就一致。可接受限度可接受限度n内毒素限度n在内毒素经各个去除步骤后，内毒素对最终产品的残留量是更值得关注的。n内毒素通常只在最后的冲洗水测定，限度设定通常是注射用水标准0.25EU/ml。n对于用大肠杆菌进行的细菌发酵（革兰氏阴性细菌，在冲洗过程中能够生产大量的内毒素），在发酵和收获步骤后的清洗符合注射用水限度，是不可能完成的，这种情形下，其它公司在更高的水平设置内毒素限度，例如5-25 EU/ml。可接受限度可接受限度n视觉清洁标准：不得有可见残留物。根据经验数据，目检能发现最低的残留物限度是1g/cm2。n视觉检验是核实残留物去除的一种直接衡量
22、手段，很容易完成。做到每个样品都检。设备表面无可见残留物n检查要包括两个部分 终洗水或淋洗水无可见残留物取样方法取样方法n取样方法应根据设备的类型、被取样点的材料、设备的构型等综合考虑。必要时可采用几种不同的取样方法，使样品具有更好的代表性。取样方法应是实用的，易培训的，否则清洁的状态难以监控。n取样方法:n直接取样法（目检）、n冲洗取样、n擦拭取样、n空白模拟取样。GM取样方法取样方法n擦拭取样具有机械力，可以取到难溶性的残留，可以分析特殊的区域、难清洁的区域，但有些区域无法进行取样。应详细规定擦拭溶剂和药签，药签的湿润程度，擦拭的力度、角度、路线、擦拭面积等。n最终冲洗水取样要求待测残留物
23、具有良好的溶解性，适用于大面积，无法直接取样或不能拆卸的设备。取样应规定冲洗方式和冲洗量，确保残留物能够溶解到冲洗水中，并且要避免大量冲洗水稀释残留污染物。此外，小的部件还可以拆卸后浸入浸提液取样。GMu擦拭取样TOC擦拭采样u 取样前首先目测，确保无可见残留物。u 选定所要擦拭的表面积。将擦拭子润湿，然后按在取样表面上，用力将其稍微弯曲，使棉签整个平面接触擦拭表面，平稳而缓慢的擦拭取样表面，具体擦拭方法见下图。取样方法取样方法 每个取样部位每次采样用1根TOC专用棉签擦拭。擦拭完成后，将TOC专用药签折断，放入40ml TOC专用瓶内，把盖子密封好，进行编号。u最终冲洗水取样n测外观、电导、
24、pH取样要求用透明洁净的玻璃瓶取样150ml（每项50ml），取样前玻璃瓶用注射用水荡洗3遍。n测TOC水样取样要求用TOC专用取样瓶装满样品，取样瓶在取样前先用注射用水荡洗3遍。n检微生物取样要求用无菌50ml离心管取样50ml，取样后离心管应用封口膜密封。n测细菌内毒素取样要求用无菌无热源注射器或离心管取样5ml，取样后离心管应用封口膜密封n蛋白残留量洁净1.5ml EP管取1ml，取样后EP管应用封口膜密封。取样方法取样方法u最终冲洗水取样n层析柱终洗水取样要求检外观、电导、pH、细菌内毒素、微生物、蛋白残留量项目的取样要求同上。应注意层析柱流出管道应垂直悬空，必要时，取样前管道先用消毒
25、酒精擦拭，排掉部分流出液后取中段样。n层析柱空白样取样要求检外观项目用透明洁净玻璃瓶取50ml；检蛋白残留量/宿主菌蛋白质/外源性DNA残留量用无菌无热源离心管取5ml；检内毒素用无菌无热源离心管取5ml；微生物项目用无菌离心管取50ml，取样后离心管用封口膜密封。取样方法取样方法u空白模拟取样n在生物制药中，空白模拟取样一般仅包括注射用水或不含产品的工艺缓冲溶液。在此取样过程中，设备是清洁的。清洁后，只使用注射用水或缓冲液运行生产流程（尽最大可能）。运行后，像任何其它清洁验证的样品一样，对注射用水或缓冲液进行评价，项目通常包括TOC(或总蛋白)、电导率、生物负载和内毒素，分析所制造产品的残留
26、物是否成为任何可能的污物。在原液和制剂生产中都可以进行空白模拟运行，以论证工艺材料的实际污染量。取样方法取样方法取样点的选择取样点的选择n选取取样点应考虑设备最难清洗部位、关键部位、最有代表性部位、结构材料的不同部位、取样点的方便性和重现性、设备的总尺寸。n对于擦拭取样，通常不可能擦拭设备的全部表面，因此，应该选择设备的最差区域作为取样点。这些区域应在清洁难度和残留水平方面代表着对清洁规程最大程度的挑战，例如：人孔、料斗的底部、桨拌桨叶底部和阀门的周围。n如果进行微生物取样，取样计划应包括微生物的可能最差区域，例如：较难靠近的地方以及可收集水的排水区域。微生物和化学取样应在不同区域进行，测试方
27、案中应包括设备及其取样点的描述或图表。n对于最终冲洗水取样，取样时要从设备专用取样口或者产品出料口取样。检验方法检验方法n特异性：活性成分n色谱分析：HPLC,GC,高效薄层色谱（HPTLC）是非常灵敏和有效的。nELISA：对于生物药非常有效，但是昂贵、费力。n电泳：灵敏度较低n非特异性nUV光谱：有适度的特异性，不需要定量检测。nTOC:针对通用污染物或总蛋白。总有机碳分析仪是非常灵敏的，但不是特定的。应该和pH与电导率一起使用。npH：请氢离子非常敏感。用于清洁程序中的酸和碱的追踪。n电导率：对所有离子敏感。（当TOC、pH和电导率联合使用时，在清洁验证分析方法中被证明是非常有效的。）n
28、内毒素及微生物特殊设备的清洁验证特殊设备的清洁验证n特殊设备的清洁验证层析柱层析填料结构复杂，是多孔性颗粒，无法进行彻底清洁，因此层析填料需要品种专用。对层析填料的清洁验证，单纯通过对最终清洗水的检验是不够的，因为残留在层析填料上的污染物可能无法被清洗液洗出，却可能在纯化过程中被洗脱液洗出来。因此层析填料的清洁验证需要做空白模拟纯化，即用平衡液代替蛋白质中间体，按中间体纯化工艺进行操作，在纯化收样位置收样，收样体积与中间体纯化收样体积相当。空白运行收样样品再送检污染物残留。层析柱的筛网难以清洁，也不宜多品种共用。不必在每次清洁验证都进行层析填料的空白模拟纯化，如果有层析填料寿命验证数据或历史经
29、验数据，可以延长做空白模拟纯化的周期。特殊设备的清洁验证特殊设备的清洁验证n特殊设备的清洁验证切向流过滤膜与层析填料类似，具有多孔性，属于难以彻底清洁的设备，这类设备应该专用于单一品种的单一中间体。其清洁验证也可以定期做空白模拟纯化。清洁验证状态的维持及再验证清洁验证状态的维持及再验证n验证状态的维持是日常生产与质量控制的组成部分。n弥补验证实验次数有限的缺点n定期取淋洗水或擦拭样化验n变更管理，再验证n已验证的清洁规程应进行定期监控或定期再验证。再验证的频率应根据风险分析确定。当设备有重大变化（包括面积改变），增加生产更难清洁的产品，工艺变更带来新的物质，清洁剂或清洁程序有实质性变化、批量或
30、组分改变等都应该进行再验证。偏差与变更控制偏差与变更控制n验证过程中出现的偏差均应记录在案，并由专门人员讨论并判断偏差的性质，确定是否对验证结果产生实质性影响。根据欧盟GMP，清洁验证不应采用“不断测试，直至清洁”的方式。如检验结果超出限度，并经证明并非分析化验误差所致时，该偏差应作为关键偏差。应对此进行原因调查，确定原因并采取必要措施后重新进行验证试验。n变更控制系统必须涵盖所有的关键参数和清洁系统主要部件，以确保所有可能会影响到验证状态的风险都会被评估。在系统中不仅要重视对每个变更的审核，同样也要重视对于多个累积变更产生的影响的审核。一些次要变更（看似对验证状态不会造成影响的变更）累积起来就有可能会对验证状态造成影响。案例分析案例分析谢谢 谢谢 ！
