1、免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 第一节第一节 基基 本本 原原 理理 抗原抗原抗体（特异性）抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的定位组织或细胞内抗原的一门技术。一门技术。免疫酶组织化学技术2免疫酶组化免疫酶组化 免疫学免疫学(抗原抗体反应抗原抗体反应)酶细胞化学酶细胞化学(底物显色反应底物显色反应)+特异性特异性 敏感性敏感性 定位性定位性 可视性可视性免疫酶组织化学技术3PAP法法免疫酶组织化学技术4免疫酶组织化学基本组成：免疫酶组织化学基本组成：抗原抗原 抗体抗体 放大系统放大系统 显色系统显色系
2、统免疫酶组织化学技术5ABC法法免疫酶组织化学技术6免疫酶特点：免疫酶特点：信号定位准确信号定位准确 标本可长期保存标本可长期保存 阳性标记与病变关系阳性标记与病变关系 方法简便，易推广方法简便，易推广免疫酶组织化学技术7 一、酶及其特点一、酶及其特点 酶选择标准：酶选择标准：该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。或电镜观察。酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。定位。第二节第二节 酶酶 和和 底底 物物免疫酶组织化学技术8 酶易于纯化，获得纯制品。酶易于纯化，获得纯制品。酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶与免疫
3、球蛋白结合后，不丧失其活性。酶在酶在PH中性液内较稳定。中性液内较稳定。组织中不应存在与底物作用的内源性酶。组织中不应存在与底物作用的内源性酶。免疫酶组织化学技术9符合上述条件：符合上述条件：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶免疫酶组织化学技术10（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）分子量（分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少
4、可作用于多种底物，产生不同颜色可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内穿透力强，易进入细胞内免疫酶组织化学技术11 （二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱组织穿透能力较弱 内源性内源性AKP较高较高 左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 免疫酶组织化学技术12 （三）葡萄糖氧化酶（三）葡萄糖氧化酶（GODGOD）底物为葡萄糖，终产物稳定底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱分子量大，穿透力较弱 免疫酶组织化学技术13 二、底物及其特点二、底物及其特点 酶
5、酶底物底物酶酶底物底物酶酶产物（显色）产物（显色）免疫酶组织化学技术14HRP的底物：的底物：HRP的底物为低浓度的的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。供氢体为胺类及酚类化合物。免疫酶组织化学技术15HRP显色反应：显色反应：HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）电子供体（氧化型）电子供体电子供体免疫酶组织化学技术16 电子供体被氧化后，迅速改变电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。性有色颗粒，并就地原位沉淀。免疫酶组织化学技术17HRP常用的电子供体：常用的电子供体：3.3-二氨基联苯胺二氨基
6、联苯胺(DAB)棕色棕色 氨乙基卡巴唑氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。易扩散，用水溶性封固剂。4-氯氯-1-茶酚（茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保）蓝色，易弥散，不能久保存存 3.3，5.5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)黄色黄色免疫酶组织化学技术18AKP底物：底物：AKP常用的底物为常用的底物为-萘酚萘酚AS-B1磷酸盐磷酸盐 偶联试剂：偶联试剂：固兰固兰BB蓝色蓝色 固红固红TR红色红色 免疫酶组织化学技术19第三节第三节 酶标记抗体法酶标记抗体法 酶标记抗体法（酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibo
7、dy）是将酶通过共价键结合在）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。过抗体去寻找相应抗原。免疫酶组织化学技术20一、直接法一、直接法原理：原理：HRP标记在特异性抗体标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原（第一抗体）上，抗原-抗体抗体 HRP复合物复合物免疫酶组织化学技术21组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法免疫酶组织化学技术22步骤：步骤：一步完成一步完成特点：特点：方法简便、省时，专一方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻，性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记但敏感性差，一种标记 抗体
8、只能检测一种抗原。抗体只能检测一种抗原。免疫酶组织化学技术23二、间接法二、间接法原理：原理：HRP标记在第二抗体上，标记在第二抗体上，抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体二抗体 HRP复合物复合物步骤：步骤：二步法二步法免疫酶组织化学技术24组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法免疫酶组织化学技术25特点：特点：敏感性较直接法高，一敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特但较直接法费时，非特 异染色稍重。异染色稍重。免
9、疫酶组织化学技术26第四节第四节 酶酶 抗抗 酶酶 法法 制备抗酶抗体制备抗酶抗体 制备制备PAP复合物复合物免疫酶组织化学技术27酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）第三抗体（抗酶抗体）HRP免疫酶组织化学技术28一、一、PAP法法原理：原理：抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体（桥抗体）二抗体（桥抗体）-PAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法免疫酶组织化学技术29组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物PAP法法HRP免疫酶组织化学技术30特点：特点：敏感性较高，背景染色较轻敏感性较高，背景染色较轻 但特异性
10、抗体与但特异性抗体与PAP必须为必须为 同一种属动物同一种属动物 免疫酶组织化学技术31二、双二、双PAPPAP法：法：原 理：原 理：在在 P A P 的 基 础 上 再 重 复的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和第二抗体和PAP复合物复合物抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第二抗体（桥抗第二抗体（桥抗体）体）-PAP-第二抗体第二抗体-PAP复合物复合物 免疫酶组织化学技术32组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物双双PAP法法HRP免疫酶组织化学技术33双双PAP法法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP免疫酶组织化学技术34
11、步骤：步骤：五步法五步法 特点：特点：敏感性较高敏感性较高缺点：缺点：但步骤多，费时，非特但步骤多，费时，非特 异背景重异背景重免疫酶组织化学技术35三、三、APAAPAPAAP法法原理：原理：抗原抗原-特异抗体特异抗体-第二第二 抗体抗体-APAAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法免疫酶组织化学技术36APAAP法法免疫酶组织化学技术37特点：特点：非特异背景较轻，不受内非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂但产物易溶于有机溶剂免疫酶组织化学技术38 第五节第五节 卵白素卵白素-生物素生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相为一种硷性糖蛋白，由四个相
12、同亚基组成同亚基组成Biotin小分子维生素小分子维生素Avidin和和Biotin具有较高亲和力具有较高亲和力免疫酶组织化学技术39一一 、ABC法法 Avidin Biotin Complex原理：原理：酶标记酶标记Biotin形成酶素化形成酶素化 Biotin免疫酶组织化学技术40 酶素化酶素化BiotinAvidin-ABC 复合物复合物 抗原抗原-特异抗体特异抗体-Biotin标记标记 第二抗第二抗-Avidin Biotin HRP 免疫酶组织化学技术41组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体HRP生物素生物素卵白素卵白素ABC法法免疫酶组织化学技术42步骤：步骤：三步法
13、三步法特点：特点：敏感性较高，特异性强，敏感性较高，特异性强，应用范围广应用范围广 免疫酶组织化学技术43 某些脏器存在内源性生物素某些脏器存在内源性生物素 干扰干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应有非特异反应免疫酶组织化学技术44SABC法法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替法已代替ABC法法免疫酶组织化学技术45 二、二、LSAB法法 Labelled Streptavidin Biotin Method原理：原理：Biotin标记第二抗体标记第二抗体免疫酶组织化学技术46LSAB法法免疫酶组
14、织化学技术47 HRP标记标记Avidin 抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-Biotin标记标记第二抗体第二抗体-Avidin HRP复合物复合物 免疫酶组织化学技术48步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性高，特异性强，敏感性高，特异性强，方法简便方法简便免疫酶组织化学技术49第六节第六节 多聚合物酶法多聚合物酶法 HRP-HRP-多聚合物多聚合物-抗体抗体 一、一、Epos法法 Enhanced polymer one-step staining免疫酶组织化学技术50多聚合物酶法多聚合物酶法免疫酶组织化学技术51组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚骨架多聚骨架EPOS 方法方法免疫酶组织
15、化学技术52步骤：步骤：一步法一步法特点：特点：快速，简便，特异性强，快速，简便，特异性强，敏感性高敏感性高 但商品化种类不全，但商品化种类不全，价格昂贵价格昂贵免疫酶组织化学技术54二、二、EnVision法法 Enhanced Labelled Polymer System原理：原理：HRP-多聚合物多聚合物-第二第二 抗体抗体免疫酶组织化学技术55组织抗原组织抗原一抗一抗二抗二抗酶酶多聚骨架多聚骨架第一步第一步第二步第二步EnVisionTM方法方法免疫酶组织化学技术56特点：特点：敏感性高：敏感性高：（1 mole复合物中含复合物中含70mole HRP和和10 mole第二抗体）第二
16、抗体）特异性强：特异性强：复合物内无内源性复合物内无内源性Avidin和和Biotin的干扰。的干扰。免疫酶组织化学技术57第七节第七节 基本操作步骤基本操作步骤 1.抗原修复抗原修复2.内源性过氧化内源性过氧化物抑制物抑制3.正常血清封闭正常血清封闭4.第一抗体第一抗体5.第二抗体第二抗体6.酶标记体酶标记体7.DAB-H2O2显色显色免疫酶组织化学技术58第八节第八节 抗原定位及非特异染色抗原定位及非特异染色 免疫酶组织化学技术59 组织细胞组织细胞 固定问题固定问题 脱蜡不彻底脱蜡不彻底 内源性过氧化物内源性过氧化物 内源性生物素内源性生物素 免疫酶组织化学技术60抗原抗原 抗原弥散抗原弥散 抗原异常表达抗原异常表达 共同抗原决定簇共同抗原决定簇 免疫酶组织化学技术61特异性抗体特异性抗体 非特异吸附非特异吸附 抗体不纯抗体不纯 交叉反应交叉反应 免疫酶组织化学技术62 第二抗体第二抗体 IgG交叉反应交叉反应 二抗不纯二抗不纯免疫酶组织化学技术63标记物标记物 质量质量 纯度纯度 标记水平标记水平 免疫酶组织化学技术64底物溶液底物溶液 DAB H2O2 免疫酶组织化学技术65操作操作 复染复染 抗体稀释度抗体稀释度 孵育时间孵育时间 PAS洗涤洗涤 免疫酶组织化学技术66第九节第九节 免疫酶方法评价免疫酶方法评价 免疫酶组织化学技术67
