1、生物大分子的提取和纯化生物大分子的提取和纯化电泳技术电泳技术PCR技术技术核酸序列的测定核酸序列的测定蛋白质相互作用蛋白质相互作用AgrosePAGE双向电泳 杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化检测和纯化分离生命现象生化组分分析1、结构与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法v经典的研究步骤：分离生化组分（细胞器和生物分子）；分析生化组分的结构；分析生化组分的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。11/10/20223生物化学研究技术方法l 生物化学研究技术：分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、层析、电泳等
2、；分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。11/10/20224生物大分子分离纯化的一般步骤和原则生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）酶解、化学处理）生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品
3、粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。p各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。p其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。p对其他生物分子的特殊亲和力。分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序1、材料的选择和预处理、材料的选择和预处理 2、破碎细胞
4、及提取（有时还需要进行细胞器、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）的分离）3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。处理。生物大分子的浓缩p沉淀法沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。p盐析法：盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等。p 吸附法吸附法：将干葡聚糖凝胶加入
5、提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。p 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。p 透析浓缩法p 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。p 冰冻干燥法纯度鉴定纯度鉴定l 生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。度。l 蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。心沉降分析法等。l 纯的
6、蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。l 选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用的纯度，必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。蛋白质、核酸的定性定量检测蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定、蛋白质的测定 凯氏定氮法（凯氏定氮法（含含N量量 6.25）双缩脲法、双缩脲法、Folin
7、-酚法酚法 紫外光度法（紫外光度法（max=280nm）离心法、电泳法、层析法离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定、酶活力的测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸的测定、氨基酸的测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸的测定、核酸的测定 紫外光度法（紫外光度法（max=260nm）分子杂交法分子杂交法 离心法、电泳法离心法、电泳法l 核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280A260/A280）等方法。等方法。v同
8、蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-32-3种方种方法才能确定。法才能确定。电泳基本原理l 电泳电泳是不同的物质颗粒在是不同的物质颗粒在一定的电场强度一定的电场强度下，由于下，由于所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。l 在一定在一定pH条件下，每一种分子都具有条件下，每一种分子都具有特定的电荷特定的电荷（种类和数量）、（种类和数量）、大小大小和和形状形状，在一定时间内它们，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的
9、位在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理基本原理。电泳带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维
10、素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。l 影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：1.电场强度：l 电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。2.溶液溶液pHl 为使电泳时为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所
11、带电荷的多少。多少。3.离子强度（离子强度（I）溶液的溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。清晰。4.电渗电渗l 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗电渗。如纸电。如纸电泳时，滤纸吸附泳时，滤纸吸附OH-OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好故电泳时，电渗小些为好5.温度温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率电泳时会产生焦耳热，使
12、介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。6.支持物支持物|现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色等后续处理。等后续处理。电泳技术分类|按电泳的原理来分，可分为四种：区带电泳区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的
13、缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。移界电泳：移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。等速电泳：等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带相随并形成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦：等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同）DNA的琼脂糖凝胶电泳：l 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子相对分子质量及分子构
14、型质量及分子构型，同时与，同时与凝胶的浓度凝胶的浓度也有密切关系。也有密切关系。l 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系l DNA分子的大小：l在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。l但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。l琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。2.琼脂糖凝胶电泳l 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳
15、分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系F不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA（cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNAF当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rf=0），而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进（Rf0），由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称称Acr）和交联剂）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（简称（简称Bis）在）在加速剂加速剂和和催化剂催化
16、剂的作用下的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳（简称（简称PAGE）。）。l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。对对pH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，只要几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。品分离重复性好。样品不易扩
17、散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。电泳等有更高的分辨率。l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：p 分离范围不同分离范围不同 琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，
18、氨基酸等。p 凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。p 凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同l琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成.，分辨率高。p 成本不同成本不同。琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高p 安全性不同安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性l 凝胶聚合的原理及有关特性凝胶聚合的原理及有关特性催化系统常用有两种：催化系统常用有两种：l 过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）
19、称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。l 核黄素核黄素TEMED光聚合催化系统光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。凝胶聚合的原理及有关特性影响凝胶聚合的因素 AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，避光的条件下保
20、存，其水溶液应置棕色瓶中，4冰箱贮存，一般仅冰箱贮存，一般仅能存放一周。能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于（液状）应密闭贮于4冰箱中。增加冰箱中。增加AP和和TEMED可加快聚合速率，但过量的可加快聚合速率，但过量的AP和和TEMED会引起电泳时烧胶会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。内完成。pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少时应减少AP和和TEMED用量，制酸性胶可加用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。等促进聚合。温度：温度高聚合快，但
21、高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5)聚合凝胶会变得脆聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般而混浊，一般25-35聚合较好。聚合较好。氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。再加引发剂。PAGE原理l PAGE据其有无浓缩效应，分为据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统连续系统与不连续系统两大两大类。类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pH、凝胶浓
22、、凝胶浓度及电位梯度的不连续性度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应电荷效应、分子筛效应分子筛效应，还具有浓缩效应浓缩效应，故分离效果更好。l不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓所谓变性凝胶变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如即在凝胶中加入变性剂，如尿素、尿素、SDS(十二烷基磺酸十二烷基磺酸钠钠)、巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破
23、坏或改变蛋白质的结构，等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。任何电荷。l 由于由于SDSSDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质
24、均带有相同密度的负电荷，因而可利用原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用MrMr差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入在蛋白质溶解液中，加入SDSSDS和疏基乙醇，巯和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。膜分离基本技术 膜分离与常规的分离技术相比膜分离与常规的分离技术相比 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优点 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。11/10/202227膜纵切面模式图膜纵切面模式图以分离应用领域过程分类微滤(micr
25、o-filtration,MF)超滤(untra-filtration,UF)反渗透(reverse osmosis,RO)透析(Dialysis,DS)电透析(electro-dialysis,ED)纳米膜分离(NF)亲和过滤(affinity filtration,AF)渗透气化(pervaporation,PV 膜分离基本技术 膜分离过程的推动力是膜分离过程的推动力是静压差、浓度差或者电位差，静压差、浓度差或者电位差，有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。膜在分离过程中有三种功能：膜在分离过程中有三种功能：物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间
26、实现分离的内在因素界面作用，以膜为界面将透过液和保留液分为互不混合的两相反应场作用，膜表面及孔内表面含有与特性溶质有相互作用能力的官能团，通过物理作用、化学反应或生化反应提高膜分离的选择性和分离速度。11/10/2022生命科学学院生命科学学院2911/10/202229生命科学学院生命科学学院 分离膜 分离膜应具备的基本条件为：好的选择透过性；良好的分离性能（即截留率高，透过率大）；理化性能良好；污染小，使用寿命长；价廉易得。各种分离膜按所使用的材质不同可分为无机材料膜和有机材料膜。无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜，无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜，有机膜多为合成高分子材料膜，主要有纤维素类、有机膜
27、多为合成高分子材料膜，主要有纤维素类、聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。11/10/2022生命科学学院生命科学学院3011/10/202230生命科学学院生命科学学院膜分离基本技术 分离膜 分离膜的分离膜的性能参数主要有：主要有：孔道特征、渗透通量、孔道特征、渗透通量、截留率和截留相对分子质量等。截留率和截留相对分子质量等。孔道特征包括孔道特征包括孔径大小，孔径大小用最大孔径和平均孔径来描述孔径分布，孔径分布指各种孔径的孔占全部孔的体积分数。孔隙率，孔隙率是指孔体积占膜总体积的百分数。11/10/2022生命科学学院生命科学学院3111/10
28、/202231生命科学学院生命科学学院透析和超滤透析和超滤 J透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。J超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。透析方法示意图透析方法示意图沉淀与离心沉淀与离心J 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物
29、中沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。J 实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。J 离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下通过溶液发生沉降。J 差速离心和密度梯度离心 离心机的使用 高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因
30、此当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。11/10/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院37 层
31、析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。层析层析 层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用
32、（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到分离各组份的目的。表表1 1 主要的层析方法及其原理主要的层析方法及其原理名称吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析疏水层析亲和层析分离原理各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同
33、与离子交换树脂的亲和力不同固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合能力不同固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组份分离的目的层析基本操作过程层析基本操作过程 装置选择装置选择上样和洗脱上样和洗脱结果检测结果检测 上样均一性上样均一性 洗脱装置洗脱装置目的不同目的不同 检测方法不同检测方法不同活性检测活性检测基质均匀性基质均匀性柱层析的柱层析的L/d比值比值洗脱装置洗脱装置v 不改变溶剂体系不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的依靠液面的水位差产生的静压力静压力致使洗致使洗
34、脱液不断流经层析柱脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵蠕动泵或恒流泵 改变溶剂系统改变溶剂系统 分级洗脱分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂
35、离子强度疏水层析离子交换层析 改变溶剂系统改变溶剂系统 梯度洗脱梯度洗脱 一种溶液以一种溶液以恒定的速度恒定的速度连续地进入处于温和搅拌连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速混合后的液体以同速度沉入层析柱度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以一种溶液的浓度以线性梯度方式线性梯度方式连续地发生改变。连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。接近的蛋白质。性能未知样品的蛋白质分离：性能未知样品的蛋白质分离
36、：改变缓慢的梯度洗脱改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱若为单峰：分级洗脱离子交换层析离子交换层析原原 理理l离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。l原理：原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。选择离子交换剂的一般原则：选择离子交换剂的一般原则：根据所带的电荷性质。如带根据所带的电荷性质。如带正电荷正电荷，应选，应选择择阳离子交换剂阳离子交换剂；如带；如带负电荷负电荷，应选择，应选择阴阴离子交换剂离子交换剂；如为两性离子，根据其在稳；如为两性离子，根据其在
37、稳定定pHpH范围内所带电荷的性质选择。范围内所带电荷的性质选择。在分离生命大分子物质时，选用在分离生命大分子物质时，选用亲水性基亲水性基质质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。离子交换树脂的处理，再生等概念 离子交换层析技术的应用离子交换树脂分离氨基酸离子交换树脂分离氨基酸分子筛示意图分子筛示意图亲和层析示意图亲和层析示意图亲和层析亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底
38、物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。配基与偶联凝胶的选择与处理配基与偶联凝胶的选择与处理 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix)(又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载
39、体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm)。偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基团。亲和层析的操作条件亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低温(4)下进行。亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。最后用平衡缓冲液使亲和层
40、析柱平衡，即可重复使用。暂时不用时，亲和层析柱应置于4低温保存。蛋白质研究方法蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X X1.如何得到这种蛋白质?蛋白质的分离、纯化技术2.这种蛋白质的大小？（SDS-PAGE）3.它的pI是多少？（等电聚焦）4.其他细胞或其他生物体内是否存在？（Western印迹）5.其一级结构如何？（序列分析）6.其三维结构又如何？X-射线衍射和核磁共振蛋白质纯化蛋白质纯化一、准备工作：要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除
41、残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定蛋白质和酶纯化的常见方法和方案设计 分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水性、与特定配体结合的性质等。常用的方法有：沉淀（溶解性）；离子交换（电荷）；聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特异性结合）。蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般经过四个阶段：（1）破碎细胞或
42、组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包括纯度、大小或pI的测定。蛋白质纯度的鉴定（1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心，因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧的两个不同的pH 值分别进行检测，这样得出的结论才更可靠；（2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白
43、质只有一条链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸；（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 直接测定法 间接测定法：先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然
44、后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。WesternWestern印迹印迹蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2 2DEDE）原理）原理:先根据蛋白质的等电点不同在先根据蛋白质的等电点不同
45、在pH梯度介质中梯度介质中进行第一次分离，即进行第一次分离，即等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing,IEF），然后根据蛋白质分子量的不同），然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳完整的实验步骤包括：完整的实验步骤包括：样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定 1.样品制备样品制备 样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来决定具体的实验方法。决定具体
46、的实验方法。蛋白样品的蛋白样品的有效溶解有效溶解是成功分离蛋白质的最关键的因素之是成功分离蛋白质的最关键的因素之一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏。完全破坏。制备样品的原则样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白的损失或丢失。裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细胞应在低温下进行(冰水浴或4)，最好用加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂
47、解。样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而且要采用高纯度的去离子尿素蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或-80分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后，不要加热蛋白样品。当样品中含有尿素时，加热绝对不要超过37.升高温度会使尿素水解成异氰酸盐(isocyanate),使蛋白发生氨甲酰化(carbamylation)修饰。最好用强烈变性剂直接裂解样品，这样可以使蛋白水解酶立即变性失活。提高2DE分辨率的策略首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条如果pH线性分布的胶条分离效果不好
48、，可采用非线性胶条加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率第二向采用梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白的fractionation处理,富集低丰度蛋白分子杂交技术分子杂交技术 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。生物分子的一门技术。样 品 制 备电 泳杂 交转 膜结果显示探探 针针 制制 备备分分 子子 杂杂 交交 原原 理理 及及 流流 程程 图图表表2 各种印迹技术各种印迹技术印迹类型 转移到膜上的分子探针获得的信息Southern DNA片段 放射性标记的互补RNA或D
49、NA 基因结构等 Northern RNA放射性标记的互补RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western 蛋白质 一级抗体和与酶偶联的二级抗体 特定蛋白质的大小、分布和含量核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。杂交有固一液相杂交和液相杂交。影响杂交的因素影响杂交的因素 1、核酸分
50、子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度：（1）低盐浓度时
