1、出凝血基础理论出凝血基础理论患患 者者血栓血栓出血出血疾病来自疾病来自血小板血小板凝血因子凝血因子纤溶纤溶2一种精细的平衡一种精细的平衡 存在抑制物存在抑制物*Pharamacologic(warfarin,heparin)Allo or Auto-antibodies to Factors 天然抑制物天然抑制物*Activated Protein C Protein S Anthrombin 出血出血 血栓血栓3止凝血风险止凝血风险 一种连续统一体一种连续统一体因子因子抑制物抑制物Across the range of“Normal”there is aAcross the range of
2、“Normal”there is a30-fold increase in Thrombin generation30-fold increase in Thrombin generation50%50%150%150%150%150%50%50%.“正常正常”4止止 血血p保持血液在血管内呈流动的状态并维持血液循环p目的是终止出血并仅针对受伤部位p参与成分 -血小板 与一期止血有关 -凝固系统 与二期止血有关 -纤溶系统 -感染 -创伤复原过程5血小板血小板RBCRBC出血出血黏附黏附聚集聚集凝固反应凝固反应初级血栓初级血栓二级血栓二级血栓纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块内皮层内皮层血管内皮受损血管
3、内皮受损止凝血的过程止凝血的过程6止凝血的过程止凝血的过程凝血酶凝血酶黏附和聚集黏附和聚集纤维蛋白纤维蛋白止血块止血块血小板的黏附和聚集血小板的黏附和聚集0 min0 min10 min10 min5 min5 min二级止血初级止血凝固凝固7止凝血的过程止凝血的过程8一一 期期 止止 血血9初级止血初级止血p最先是由血管受损后引起血小板的的生理反应以阻止出血p机制 -血小板经凝血酶刺激而活化 -血小板经 GPIb 和 von Willebrand 因子(VWF)之间的交互作用黏附变形 -血小板颗粒物质的释放以补充更多血小板到受损部位 -血小板的聚集在GPIIb/IIIa(a aIIbb b3
4、)和纤维蛋白原交互作用下以形成最初的栓子 p引发二期止血(凝固蛋白)p受药物的影响，血小板功能状况及血管壁状况的影响10一期止血的检测实验一期止血的检测实验p出血时间 -Assesses all components of Virchows triad -体内测试 直接在患者身上执行 -使用替代的工具进行“体外”出血时间的检测p血小板聚集 -检测血小板聚集的能力，通过体外添加不同的诱导剂 -主要用于评价血小板糖蛋白 IIb/IIIa 受体的功能pVon Willebrand 因子(VWF)测试 -测定VWF的数量和功能,协同血小板在受损部位发挥黏附的作用 -评价VWF 与血小板糖蛋白 Ib 受
5、体交互作用的功能11二二 期期 止止 血血12二期止血二期止血p 血液凝固过程p 机制 -凝固蛋白相继激活形成凝血酶 -凝血酶使纤维蛋白原形成纤维蛋白 -纤维蛋白加固在一级止血中形成的血小板栓子成为更稳固的 血栓块(二级止血栓子)p 防止受损部位进一步的血液流失13凝凝 血血 因因 子子p Factor XII(FXII)p Factor XI(FXI)p Factor X(FX)p Factor IX(FIX)p Factor VIII(FVIII)p Factor VII(FVII)p Factor V(FV)Factor II(凝血酶原)转化为凝血酶(FIIa)Factor I(纤维蛋白
6、原)转化为纤维蛋白activated FXII(FXIIa)activated FXI(FXIa)activated FX(FXa)activated FIX(FIXa)activated FVIII(FVIIIa)activated FVII(FVIIa)activated FV(FVa)14FVIIIa凝凝 固固 的的 瀑瀑 布布 学学 说说FXIFIXFVIIFibrinogenFibrinFXIaFVIIaTFCa+PLFXFXaFIIThrombinFVaFXFXIIFXIIaFIXaCa+PLCa+PLTF=Tissue FactorCa+=Calcium ionPL=Phosph
7、olipid15“体内体内”v v“体外体外”凝固凝固p生理(“体内”)凝固依赖于组织因子途径 -目的是形成血栓p实验室(“体外”)凝固依赖于接触系统 -经典的瀑布学说原理 通过一步步的生物化学反应使不具活性的酶原依次转化成具有 活性的酶 -放大的过程(以分钟计量的 Factor XII 产生大量的凝血酶)-目的是形成凝固块16更新的二期止血更新的二期止血组织因子联合FVIIa 在创伤处启动凝固少量形成的凝血酶激活血小板凝血因子在血小板表面形成复合物大量形成的凝血酶使纤维蛋白原转化成纤维蛋白纤维蛋白加固了血小板栓子(一期止血)并使止凝血完成17 止凝血止凝血发生的时间构成发生的时间构成血小板血
8、小板凝血凝血因子因子纤溶纤溶蛋白蛋白一期止血一期止血 血管立即收缩 在很短时间内血小板黏附（即时）几分钟内血小板聚集二期止血二期止血 几秒内凝血因子活化 几分钟内纤维蛋白形成纤溶纤溶 纤溶蛋白立即发生激活 血栓的溶解需要几小时18出血出血:平衡被打破平衡被打破 存在的抑制物存在的抑制物*Pharamacologic(warfarin,heparin)Allo or Auto-antibodies to FactorsThrombosisThrombosis19血栓血栓:平衡被破坏平衡被破坏InhibitorsInhibitors*Activated Protein C Protein S An
9、thrombin20结结 论论p一期止血，血小板参与的过程，当血管受损时形成止血栓子p二期止血，凝血因子参与的过程，始于组织因子暴露 -由 TF:FVIIa 复合物(“外源途径”)激活FXa形成少量的凝血酶 -同样的同样的在活化的血小板表面经 FIXa 和 FVIIIa-为中间复合物激活FXa形成凝血酶 -大量凝血酶的产生显示出血或血栓的危险21凝血实验室检查凝血实验室检查22实验室检查实验室检查外源途径外源途径XIIXII组织因子组织因子PTPT外源外源+共同共同纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块内源途径内源途径XIXIIXIXVIIIVIIIX XV VII IIVIIVIIAP
10、TTAPTT内源内源+共同共同途径途径共同共同23样样 本本p 血液收集于枸橼酸钠抗凝的试 管中p 由于枸橼酸钠结合了钙使血液 保持流动，可用于检测凝固功 能。p 将试管经过离心分离血浆层(白细胞&血小板)和红细胞p 用于测试的血浆-血浆含有纤维蛋白原 -血清不含有纤维蛋白原p 血浆是“乏血小板的”血小板层留在淡黄 色层里淡黄色层红细胞层血浆24常常用凝固测试用凝固测试p 凝血酶原时间(PT)p 活化的部分凝血活酶时间(APTT)p 定量纤维蛋白原(FIB)p 凝血酶时间(TT)p 特殊凝血因子测试-基于 PT 的因子测试:FVII,FV,FX 和 FII-基于 APTT 的因子测试:FXII
11、,FXI,FIX 和 FVIII25凝血酶原时间凝血酶原时间 (PT)PT 试剂成分试剂成分凝血酶原凝血酶原 组织因子(重组/人源或动物源性脑粉)脂质 (源自血小板从血浆分离后的磷脂)CaCl2 用作再钙化，与枸橼酸钠螯合因试剂中同时含磷脂和脱辅基蛋白而成为因试剂中同时含磷脂和脱辅基蛋白而成为“完善的完善的”试剂试剂凝固形成时间凝固形成时间 12 12 秒秒 37 oC孵育孵育 3 3 分钟分钟0.1 ml 凝血活酶凝血活酶 +Ca+0.1 ml 血浆血浆外源途径外源途径VII组织因子组织因子PT外源外源+共同共同XVIICommonFibrinogenFibrin ClotPathway26
12、PT PT 测试测试p一步法:凝固激活和重钙化同时发生p凝血活酶试剂 -组织因子 TF(重组/人或动物脑粉)启动凝固 -脂质(源自血小板除去血浆的磷脂)提供凝血分子复合物反应必需的表面 -CaCl2(再次加入钙离子与枸橼酸钠抗凝剂螯合)蛋白与磷脂结合所必需的 -肝素中和剂(排除治疗用的肝素的影响或最小化)-因同时含有磷脂和脱辅基蛋白(TF)被称为“完善的”(相对于局部）凝血活酶试剂27PTPT的应用的应用p临床应用 -诊断:(FVII 缺乏的初筛实验)-治疗:口服抗凝剂治疗监测(OAC)(也指抗-vitamin K AVK 治疗)p实验应用 -外源或组织因子途径(Factor VII)-共同途
13、径(Factors X,V,II 和 I 纤维蛋白原)-3/4 vitamin K-依赖蛋白(FVII,FX,FII)FIX 用 APTT 测定28国际标准化比率国际标准化比率p“标准化”用算数的方法降低PT试剂中的差异(凝血活酶)p 仅用于监测受长期抗凝剂治疗影响的患者，稳定口服抗凝 剂的使用 -预防抗凝剂治疗不足下的再次血栓发生 -预防抗凝剂治疗过量的出血并发症发生INR=INR=患者患者 PT PT正常平均正常平均 PT PTISIISI29 PT PT延长的原因延长的原因p 缺乏或异常:-FVII(外源途径)-FV,FX,FII(prothrombin),和 FI(纤维蛋白原)PT 和
14、 APTT 同时延长p Vitamin K antagonists -PT 能敏感的检测到3/4的vitamin K-依赖的促凝蛋白减少:FVII,FX,和 FII FIX 用 APTT 测定 -抗凝剂的药学原理是使vitamin K-依赖因子不能与钙离子结合从而降低血液 凝固性p 肝脏疾病 -vitamin K-依赖蛋白合成的地方 -香豆素(warfarin)和凝固蛋白清除的地方30活化的活化的部分凝血活酶时间部分凝血活酶时间APTT APTT 试剂组成试剂组成p 激活剂使 FXII 转化成 FXIIap 磷脂(替代“体内”凝固反应发生的血小板的表面)p CaCl2 再次用到的钙离子与枸橼酸
15、钠螯合p 所说的“部分凝血活酶”是指没有用到组织因子 两步法(活化和重钙化)内源途径内源途径XIIXIIAPTTAPTT内源内源+共同共同IXIXVIIIVIII纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块凝固形成的时间凝固形成的时间 30 30 秒秒3 73 7 C C 孵 育孵 育 3 3 分 钟分 钟0.1 ml 0.1 ml 血浆血浆XIXIX XV VII II途径途径纤维蛋白原纤维蛋白原0.1 ml 0.1 ml 激活剂激活剂0.1 ml CaCl20.1 ml CaCl2共同共同31APTT APTT 实验实验p“部分凝血活酶”-没有用组织因子作为凝固的启动(激活)p两步法实验 -激活&重钙化p试剂
16、成分 -激活剂 FXII 转化为 FXIIa -磷脂 替代体内凝固反应发生的血小板磷脂表面 -缓冲液(使血浆混合反应的 pH 变化最小化)-CaCl2 再次加入钙离子与枸橼酸钠螯合32APTT APTT 试剂激活剂试剂激活剂p激活剂类型 -微粒激活剂 Kaolin(硅藻类)微粉化或胶体氧化硅 寅式盐 -非微粒激活剂 鞣化酸(液体激活剂)p激活剂使用的基本原理 -为反应的发生提供较大的表面 -测试所需的孵育影响时间 替代最初的玻璃表面用于执行部分凝血活酶时间测定(PTT)PTT凝固时间的缩短减少了测试的不精密度33APTT APTT 试剂中的磷脂试剂中的磷脂p来源 -人胎盘,兔脑,牛脑,大豆(提
17、纯),或合成类脂质p浓度 -高水平 对狼疮抗凝物不敏感(掩盖或模糊了抑制物)-低水平 对狼疮抗凝物敏感(强调抑制物的影响)p磷脂的类型 -用低水平的磷脂酰丝氨酸作为试剂对狼疮抗凝物较敏感34APTTAPTT的应用的应用p 初筛实验 内源(和严重的共同途径)的因子缺乏p 实验室监测 未组分肝素 其它抗栓药物监测(直接凝血酶抑制剂)p 狼疮抗凝物实验室检测35APTTAPTT延长延长的原因的原因p 最常见的原因 肝素(或治疗剂污染)狼疮抗凝物p 其它原因 凝血因子缺乏 FVIII(血友病 A 或 Von Willebrand 病),FIX,FXI,FXII 肝脏疾病(大部分凝血因子产生的地方)凝血
18、因子的大量消耗(如DIC)36凝血疾病的筛查凝血疾病的筛查APTTAPTTPTPTXIIXIIXIXIIXIXVIIIVIIIX XV VII III IVIIVIIp 若仅 aPTT 延长，最可能的缺乏 是 Factors XII,XI,IX 或 VIIIp 若仅 PT 延长，最可能是 Factor VII 缺乏 p 当两种初筛实验均延长时，缺乏 的是共同途径的 Factors X,V,II,和 I.37延长的延长的 PT/APTT PT/APTT PT PT延长延长 APTT APTT正常正常 PT PT正常正常 APTT APTT延长延长 PT PT延长延长 APTT APTT延长延长缺
19、乏缺乏VIIVIIVIIIVIIIX XVitamin KVitamin KIXIXV VXIXIII IIXIIXIII I接触因子接触因子Vitamin KVitamin K延长由于延长由于Warfarin Warfarin 治疗治疗肝素肝素Warfarin Warfarin 治疗治疗抑制物抑制物(特异的或特异的或 LA)LA)肝脏疾病肝脏疾病38PT PT 和和 APTT APTT小结小结p 当患者需要使用PT 和 APTT 来筛查时，都可能有潜在的出血 -若样本不存在华法令或肝素,那么:PT延长而 APTT 正常=FVII的缺乏 PT 正常而APTT 延长=内源凝血因子的缺乏(FVII
20、I,FIX,FXI,或 FXII)PT 和 APTT 同时延长=共同途径的因子缺乏(FX,FV,FII,或纤维蛋 白原)p PT,通过 INR,用于口服抗凝剂治疗的监测(warfarin)p APTT 用于肝素抗凝治疗的监测p APTT 受抑制物影响如狼疮抗凝物39纤维蛋白原测试纤维蛋白原测试凝固形成时间凝固形成时间 15 seconds 15 seconds 37 37C C 孵育孵育 2 minutes 2 minutes0.2 ml 0.2 ml 血浆血浆0.2 ml 0.2 ml 稀释的凝血酶稀释的凝血酶 定量测定纤维蛋白原定量测定纤维蛋白原p 测定血浆中存在的纤维蛋白原的总量p 低水
21、平,称为低纤维蛋白原血症，可遗传 获得但多见于获得性引起，如：DIC,肝 脏疾病或降纤治疗p 高水平可见于感染，因纤维蛋白原是急性 时相蛋白Fibrin ClotFibrin ClotII IIFibrinogenFibrinogen凝血酶时间凝血酶时间(TT)(TT)p 评估血浆中纤维蛋白原的功能p TT 凝固时间延长 -HEPARIN -直接凝血酶抑制剂 -低纤维蛋白原血症 -纤维蛋白原结构异常 -纤维蛋白降解产物升高40定量测定纤维蛋白原定量测定纤维蛋白原凝固形成时间凝固形成时间 5-14 seconds 5-14 seconds 37 37C C 孵育孵育 3 3 分钟分钟0.2 ml
22、 0.2 ml 稀释血浆稀释血浆0.1 ml 0.1 ml 凝血酶凝血酶p 定标血浆通过系列梯度稀释(1:5,1:10,1:20,和 1:40)建立参考曲线(见下图)p 病人血浆用缓冲液10 倍稀释(1:10)p 患者凝固时间为秒通过参考曲线换算为浓度 -例：患者凝固时间为 8.0 seconds 对应纤维蛋白原浓度为 281 mg/dl p 纤维蛋白原浓度与凝固时间成反比5811523046010135.018.39.52815.18.0Patientmg/dL FibrinogenClotting Time-Seconds41p 基于 PT 或 APTTp 通过稀释执行测试(1:10,1
23、份血浆加 9 份缓冲液)p 混合研究测试使用稀释的患者血浆与特异性的“乏因子血浆”来纠正 -例如:稀释的患者血浆加入乏FVIII血浆来纠正FVIII的缺乏因子活性水平的测试因子活性水平的测试举例举例患者测得的时间(50.1秒),根据参考曲线得到 FVIII 活性为 38%Reference curveInterpolatedpatient value76.276.271.071.065.765.760.560.553.853.850.150.148.148.141.441.48080757570706565606055555050454540401 1101010010038%38%Perce
24、nt Factor ActivityPercent Factor ActivityAPTT(seconds)APTT(seconds)42凝固凝固:一种平衡的行为一种平衡的行为产生凝血酶抑制凝血酶形成43凝固抑制凝固抑制外源途径外源途径XIIXII组织因子组织因子纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块内源途径内源途径XIXIIXIXVIIIVIIIX XV VII IIVIIVII抗凝血酶抗凝血酶蛋白蛋白 C C 系统系统44抑制物抑制物p 天然抑制物 -蛋白 C(活化的)和蛋白 S 抑制凝血因子 FVIIIa 和 FVa -抗凝血酶 抑制 FXIa,FIXa,FXa,FVIIa/TF,
25、和凝血酶(IIa)p 病理抑制物 -获得或自体免疫抗体对应特异性凝固因子p 药物抑制剂 -肝素和低分子量肝素 -Warfarin -直接凝血酶抑制剂45纤纤 溶溶46止血止血:一种精密的平衡一种精密的平衡形成血栓溶解血栓产生凝血酶产生纤溶酶47纤溶的降解产物纤溶的降解产物纤溶酶纤维蛋白原凝血酶纤溶酶纤维蛋白纤维蛋白原降解产物Fibrinogenolysisprimaryactivation纤维蛋白降解产物Fibrinolysissecondaryactivation48纤维蛋白纤维蛋白(原原)的的降解降解纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原碎片碎片 X XD DY YE ED DD DE
26、EE E纤维蛋白单体纤维蛋白单体纤维蛋白聚合体纤维蛋白聚合体D-dimerD-dimerFXIIIFXIIIFXIIIaFXIIIa纤维蛋白纤维蛋白凝块凝块D DD DD DD DD DFPBFPBFPA&BFPA&B纤溶酶纤溶酶E EE ED DD DD DD D凝血酶凝血酶 49测定方法测定方法50测定的方法测定的方法凝血酶凝固机制激活纤维蛋白单体聚合纤维蛋白单体可见的纤维蛋白块纤维蛋白原散射光强度加入试剂反应曲线bHdH100%可见的纤维蛋白块0%凝固时间Time50%物理改变物理改变光学改变光学改变51手工方法手工方法p 钩法钩法p 试管倾斜法试管倾斜法通过每秒倾斜试管来记录凝固形成的时间.通过每秒来回牵拉钩来记录凝固时间.37C37C凝固混匀凝固混匀52机械法机械法p 双磁黏性检测法双磁黏性检测法电磁石高频率波检测器凝固混合电磁石粘性增加p 磁珠法磁珠法粘性增加侧面顶视图凝固一旦发生珠子发生变化：记录该种变化.凝固过程37C37C凝固混合珠子传感器珠子凝固一旦发生珠子发生变化：记录该种变化.凝固过程53光学法光学法散射光(90)光源37C透射光光源37C光电探测器p 透射光方法透射光方法p 散射光方法散射光方法偏振光束穿过混合物，浊度增加引起散射光增强.偏振光束穿过混合物，浊度增加引起透射光变化.光电探测器凝固混合凝固混合54谢谢
