1、前言前言随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺癌（）的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对突变型和融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念2 2、基因突变是指发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非的检测手段如：（检测表达），免疫组、基因突变是指发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非的检测手段如：（检测表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：（检测的扩增、缺失、断裂、融
2、合）等，均不适用。化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：（检测的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体细胞突变体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1 1、突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞、突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。3基因突变检测概念基因突变检测概念突变检测指肿瘤组织中编码基因的突
3、变状态检测并不是：基因拷贝数的检测（法）蛋白表达量的检测（法）。检测检测检测物质检测物质部位部位方法方法基因突变细胞核测序法、法等拷贝数细胞核荧光原位杂交法（）蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（）表达细胞核X 2007,7:169中酪氨酸激酶区突变种类中酪氨酸激酶区突变种类标本采集及病理评估 抽提及质控检测报告突变检测测序法其它方法 突变检测流程突变检测流程突变检测中的相关角色突变检测中的相关角色患者患者临床医生临床医生胸外科医师胸外科医师内镜医师内镜医师收集肺癌组织标本收集肺癌组织标本病理科医生病理科医生准备样本准备样本实验操作及结果分实验操作及结果分析析实验室人员实验室人员报告结果给临床医生
4、报告结果给临床医生-肿瘤科医生肿瘤科医生-放疗科医生放疗科医生-呼吸科医生呼吸科医生用于突变检测的标本用于突变检测的标本肿瘤组织肿瘤组织目前最可靠的标本；目前最可靠的标本；其它样本：其它样本：外周血（血浆、血清）外周血（血浆、血清）细胞学细胞学 （胸水、痰液细胞学）（胸水、痰液细胞学）支气管刮取物支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用标本问题标本问题l石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。l石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好（50%以上）；组织部位面积约6 x 6以上；l包埋组织：组织块不小于0.50.50.5（）。l新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，保存得更完整，对实验更
5、有利，但一定要经病理学确认。l含有肿瘤组织50%以上；重量10g（约米粒大小以上），经或生理盐水冲洗干净。l取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科。l细胞学标本：可用l原发灶及复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步信息。标本因素对突变检测的影响标本因素对突变检测的影响肿瘤组织特点肿瘤组织特点遗传异质性遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂正常细胞混杂标本因素对突变检测的影响标本因素对突变检测的影响组织标本种类组织标本种类 对检测方法有相应要求，
6、组织标本及质控尤其重要对检测方法有相应要求，组织标本及质控尤其重要 冰冻新鲜组织冰冻新鲜组织 固定包埋组织固定包埋组织-外科手术标本完整，量多广泛-小活检标本完整，量少受限-外科手术标本片段化，量多受限-小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量质与量适用方法适用方法图4.基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于缓冲液，此状态可以室温保存。肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞
7、比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞 染色片用于病理评估白片用于提取建议最少切片数：手术标本，5 m X4小活检标本，5 m X8 组织标本来源组织标本来源手术标本手术标本支气管下活检支气管下活检经皮穿刺活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或新鲜冻存：液氮或-80C检测方法检测方法目前 基因突变的检测方法很多 直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50%以上，至少不低于 30%。基于实时荧光定量 基础上的方法（如 法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中 1.00.1%的突变基因，更适合
8、用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。直接测序法流程及数据分析直接测序法流程及数据分析*纯化纯化测序反应测序反应测序仪毛细管电泳测序仪毛细管电泳纯化纯化数据分析数据分析 L858R电泳质控电泳质控组织标本组织标本*是关键：是关键：特异性特异性产物长度产物长度必要时巢式必要时巢式建议通用测序引物建议通用测序引物反应反应实时定量实时定量 法操作流程及数据解读法操作流程及数据解读数据分析数据分析内参信号内参信号()突变信号突变信号:+-内参信号内参信号:+标本 1（突变阳性）标本 2（突变阴性）突变信号突
9、变信号()组织标本组织标本内参信号内参信号()测序法及法比较测序法及法比较测序法测序法敏感度20-30%1%标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高小结：小结：了解你的标本新鲜/冰冻组织组织手术标本小活检标本选择合适的方法是目前较敏感快速方法，且容易开展测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用在无肿瘤组织情况下，外周血、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测突变，但其确切的敏感度及特异性尚需进一步探索必须选择足够敏感的方法激酶抑制剂的耐药性激酶
10、抑制剂的耐药性作为临床上的最大问题，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。在治疗前很少存在T790M（13%22），这种情况下难以有效。另外50%患者中，其中大约一半患者的耐药性是由基因扩增引起的，抗药性出现时再进行基因检测，可以选择及其耐药机制相对应的治疗方法。即在一个患者的各种临床情况中，掌握及相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。激酶抑制剂耐药的处理原则激酶抑制剂耐药的处理原则对于缓慢进展的患者，建议继续使用原来的 治疗或 联合化疗；对于快速进展的患者，推荐停用
11、，改用化疗；于局部进展且原有病灶控制良好的患者，建议继续使用 并联合局部治疗。激酶抑制剂耐药研究进展激酶抑制剂耐药研究进展第一代抑制剂(易瑞沙,)和(特罗凯,)随着其在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。其中，790M突变约占临床耐药病人的60%以上。第二代抑制剂(阿法替尼)。于2013年9月批准上市，于2014年1月在3期临床研究中以失败告终。在体外对790M突变有活性，但临床仍然未能克服T790M突变产生的耐药性。第三代抑制剂。国外多个制药公司和研究机构都在开展对T790M突变的小分子抑制剂研究，其中包括克洛维斯肿瘤公司的1686和阿斯利康的9291,但还没有针对该突变的药物上市。融合基因
12、是新发现的 驱动基因，其中棘皮动物微管相关类蛋白 4（4）基因及（间变性淋巴瘤激酶）的融合（4）为最常见类型。融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，且通常及 基因突变不同时存在于同一患者。患者中 融合基因的发生率约为 5%，而在、2 或 53 等基因无突变的 患者中，融合基因阳性率达 25%；我国 和 均为野生型的腺癌患者中 融合基因的阳性率高达 3042%。病理形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中，的发生率高于其他类型的肺腺癌（46.2%8%）阳性的虽然仅占全部的5%，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例融合基因概念融合基因概念目前检测 融合基因的常用方法主要有荧光
13、原位杂交技术（）、基于 扩增基础上的技术和免疫组织化学方法（）。目前仍是确定 融合基因的参照标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，尚不适用于 阳性患者的筛查。实时荧光定量 操作简便，敏感度高，但需要特定的试剂盒和仪器。简便易行、价格便宜、操作方法成熟。融合蛋白 诊断试剂盒在不影响特异度的前提下，进一步提高了敏感度，及 结果的吻合率达到 98.8%，可重复性达 99.7%，已经获 批准用于诊断 阳性的 患者。融合基因检测方法融合基因检测方法融合基因阳性有效靶向药物融合基因阳性有效靶向药物针对靶点的小分子抑制剂克唑替尼（）是一种竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制激酶，也可抑制和1等信号通路
14、。临床试验显示对于阳性的晚期患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位为7.7个月，有效率达到65.3%4。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局（）已批准克唑替尼用于治疗融合阳性的局部晚期或转移性患者常见不良反应（发生率25%）包括视力障碍、恶心、腹泻、水肿及便秘等总结总结 患者治疗前应尽量获取标本，进行 基因突变检测；检测标本需要经过病理科医生进行质量控制，选用合适的检测方法进行检测，推荐采用高敏感度的检查方法，如 法；对于没有 基因突变的患者，建议进行 和 1 融合基因检测；建议有条件的单位同时进行 基因突变、和 1 融合基因检测。谢 谢！谢谢观赏！2020/11/528
