1、微生物的生长与控制,王莹 微生物教研室ywang,第一节 微生物的生长,生长：细胞体积的增大； 繁殖：细胞数量的增加 单细胞微生物 生长与繁殖难以区分，以群体数目的增加作为生长的标志。 多细胞丝状微生物 细胞物质量的增加作为生长的标志，通过形成孢子（有性与无性）使得个体数目的增加叫作繁殖,固体培养,菌落colony：在固体培养基上,由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的子细胞群体。 菌苔Lawn:大量细胞密集生长,结果长成的各“菌落”连接成一片。,纯培养方法,三区划线法,稀释平板法,涂布平板法,倾注平板法,1.固体斜面培养 2. 液体培养基 3. 半固体培养,全数测定 计数器法 比浊法 活菌计数 稀释
2、平板法 涂布平板法 膜过滤法 细胞物质量的测定（间接测定法）,微生物生长的测定方法,4. Direct Microscopic Count Counting chamber of known volume,干重法 含氮量法 DNA法 生理指标测定法,生长曲线,定义：少量菌种接种到一恒定容积的液体培养基中，提供最适培养条件培养，定时测定培养液中的细胞数，以培养时间为横座标，以细胞数的对数或生长速率为纵座标作图。,活菌计数比较麻烦，操作要求严格。 准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,生长曲线运用,1、用合适的菌种、菌龄、接种量和培养条件，缩
3、短迟缓期。 2、在迟缓期灭菌，保证制剂质量及减少热原质污染。 3、对数期细菌广泛用作生产种子和科研材料。 4、稳定期采取补加营养物质、移去代谢产物等延长该期，收获更多次级代谢产物。 5、芽胞于对数生长期末期开始形成、稳定期大量形成、衰亡期释放，有利于菌种保藏。,控制（有害）微生物的生长速率, 消灭不需要的微生物， 在实际应用中具有重要的意义。,第二节 微生物的控制,基本概念,1.灭菌（sterilization）杀灭所有的微生物，包括细菌的芽孢； 2. 消毒（disinfection）杀灭病原微生物，不包括芽孢。 3. 防腐（antiseptic）用理化因素抑制微生物的生长繁殖； 4. 化疗(
4、chemotherapy)：利用对病原菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖。 5. 无菌（Asepsis）：即不含活菌。灭菌是一个过程，无菌是一种状态。,控制有害菌的措施,杀灭,消毒 (部分杀灭),抑制,除菌,灭菌 (彻底杀灭),防腐 (抑制霉腐微生物),化疗 (抑制宿主体内病原菌),杀菌,溶菌,抑菌剂 杀菌剂 溶菌剂,抑菌,灭菌,菌体虽死，但形体尚存 “死有全尸”,菌体杀死，细胞溶化消失 “死无全尸”,永远丧失生长繁殖能力 高温灭菌、辐射灭菌,杀死部分对人体或动植物有害的病原菌，对被消毒的对象基本无害,物理消毒灭菌法,杀灭或抑制微生物的物理因素,温度 辐
5、射作用 过滤 渗透压 干燥 超声波等,一、温度,高温使蛋白质、核酸、细胞膜上的类脂等重要生物大分子变性、破坏，导致微生物死亡。 温度愈高，十倍致死时间愈短。,温度 微生物生长的最高温度 温度 微生物生长的最低温度,对微生物产生杀灭作用或抑制作用,高温灭菌（消毒）法,火焰灼烧法,间歇灭菌法,常规加压灭菌法,烘箱热空气灭菌法,湿热灭菌（消毒）法,干热灭菌法,巴氏消毒法,煮沸消毒法,常压下,加压下,连续加压灭菌法,1.干热灭菌法 （dry heat sterilization）,（1）火焰灼烧 灼烧（incineration或combustion）最彻底的干热灭菌方法，破坏力很强，故应用范围仅限于接
6、种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。,（2）烘箱内热空气灭菌,金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12 h后，即可达到彻底灭菌的目的。,细胞膜破坏 蛋白质变性 原生质干燥 各种细胞成分发生氧化,干热的作用：,湿热比干热灭菌更好：,潜热更大； 穿透力更强； 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构。,湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：,多数细菌和真菌的营养细胞：在63左右处理30分钟或72处理15s；（巴氏消毒法） 细菌的芽孢：121处理15分钟以上；（高压蒸汽灭菌法）,2. 湿热灭菌法 （moist heat sterilization）,湿热灭菌法是指用1
7、00以上的加压蒸汽进行灭菌。,（2）加压法 常规加压蒸汽灭菌法 连续加压蒸汽灭菌法,（1）常压法 巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法, 巴斯德消毒（pasteurization）,法国微生物学家巴斯德1865年发明，处理温度变化很大，一般在6085 处理15 s30 min。 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。目前是世界上通用的一种牛奶消毒法。,低温维持法（LTH，low temperature holding method）,高温瞬时法（HTST，high temperature short time）,在63 下保持30 min可进行牛奶消毒,
8、牛奶消毒时只要在72下保持15 s即可,巴斯德消毒的两种具体方法,优点：杀灭物料中无芽孢的病原菌（如结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。,缺点：不能杀灭芽孢和某些病原体。 例如，伯氏考克斯氏体（Coxiellaburnetii )，是一种立克次氏体，引起Q热的病原体。, 煮沸消毒法,100 处理1530 min 一般用于饮用水的消毒, 间歇灭菌法 （fractional sterilization或tyndallization）,（1）80100 下蒸煮1560 min，杀灭微生物营养体； （2）室温或37 下保温过夜，诱使残存芽孢发芽； （3）重复(1)、(2)步骤3次，达到较低温度
9、下彻底灭菌目的。,例如，培养硫细菌的含硫培养基用间歇灭菌法灭菌，其内所含元素硫在99100的温度下可保持正常结晶形，而常规的加压灭菌（121）后会引起硫熔化。,适用于不耐热培养基的灭菌。,（2）加压法, 常规加压蒸汽灭菌法 （normal autoclaving）, 连续加压蒸汽灭菌法 （continuous autoclaving ）, 常规加压蒸汽灭菌法（normal autoclaving）,一般称作“高压蒸汽灭菌法”。这是一种利用高温（而非压力）进行湿热灭菌的方法。,高压蒸汽灭菌法的原理：,将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压蒸汽灭菌锅（或家用压力锅）内，盖上锅盖，并打开排气阀，通
10、过加热煮沸，让蒸汽驱尽锅内原有的空气，然后关闭锅盖上的排气阀阀门，再继续加热，使锅内蒸汽压逐渐上升，随之温度也相应上升到100以上。,（1）121（压力为1 kgcm2或15磅英寸2），1520min； （2）115（0.7 kgcm2或10磅英寸2），30min。,适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基、物料及多种器材的灭菌 。,优点：操作简便，效果可靠，广泛使用。,缺点：破坏一些不耐热的营养成分。, 连续加压蒸汽灭菌法 （continuous autoclaving ）,在发酵行业里也称“连消法”。 将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入无菌的发酵
11、罐。,（1）135140，515 s，工业上发酵培养基 （2）135150，26 s，牛奶或其他液态食品,（超高温灭菌）,只在大规模发酵工厂中作培养基灭菌用,影响加压蒸汽灭菌效果的因素,1.杀菌物体含菌量,2.灭菌锅内空气排除程度,3.灭菌对象的pH,4.灭菌对象的体积,5.加热与散热速度,二、辐射作用,用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和-射线等,三、过滤除菌,对空气和培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法“灭菌”。,棉花、玻璃纤维或石棉,微孔滤膜0.220.45 m 醋酸纤维素、 硝酸纤维素,核孔滤器,优点：操作方法简便，不破环物质结构。 缺点：无法滤除液体中的病毒和噬菌体
12、。,过滤除菌的装置,（四）高渗、干燥、超声波等,化学消毒灭菌法,生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物。 超净工作台是在特定空间内，室内空气经预过滤器初滤，由小型离心风机压入静压箱，再经空气高效过滤器二级过滤，从空气高效过滤器出风面吹出的洁净气流具有一定的和均匀的断面风速，可以排除工作区原来的空气，将尘埃颗粒和生物颗粒带走，以形成无菌的高洁净的工作环境。,超净工作台,生物安全柜,生物安全柜,生物安全柜,本章重点,掌握：消毒、灭菌、防腐、无菌的概念； 干热灭菌法、湿热灭菌法（巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法）。 了解：影响湿热灭菌的因素，常用消毒剂的种类和应用，生物安全的概念。,下节课再见了,
