1、高效液相色谱法测定扑热息痛的含量,吉林大学国家级生物实验教学示范中心,1、目的要求 2、实验原理 3、试剂与器材 4、实验步骤 5、注意事项 6、思考题,目的要求,1掌握用外标法对比法测定药物含量的实验步骤和结果计算方法 2熟悉高效液相色谱仪的使用方法,实验原理,扑热息痛即对乙酰氨基酚，其稀碱溶液在257 1nm波长处有最大吸收，可用于定量测定。由于在其生产过程中，有可能引入对氨基酚等中间体，这些杂质也有紫外吸收。如果用分光光度法测定，杂质会对含量测定的准确性造成干扰。因此，可采用具有分离能力的高效液相色谱法将被测物和杂质分离开测定，则杂质对被测物含量测定的干扰即被消除。,试剂与器材,高效液相
2、色谱仪 色谱柱：ODS柱（150mm4.6mm,5um） 流动相：甲醇-水（40：60）流速：1.0ml/min 检测波长：257nm SGE 50ul 微量注射器,实验步骤,1、配制对照品溶液 2、样品溶液的配制 3、进样分析 4、记录格式 5、结果计算,标准品溶液的配制： 分别取母液（1mg/ml）5ml，4ml，3ml，2ml，1ml，加入标号5-标号1的100ml容量瓶中，并用去离子水稀释至刻度，摇匀。用注射器吸取标准品1 ml，过0.45um滤膜，滤液转移到1.5mlEP管中，分别标记。用微量注射器进样，记录色谱图的峰面积和出峰时间。 注意！ 0.45um滤膜可重复使用，但须反复润洗
3、！,供试品溶液的配制： 精密称取对乙酰氨基酚粉末3mg，60水浴40min，放冷10min，待基本溶解完全，置100ml的容量瓶中，加适量去离子水，振摇，加去离子水至刻度，摇匀即得。,进样分析 ： 用注射器吸取供试品约1ml，经过0.45um滤膜，滤液转移到1.5mlEP管中。用微量注射器吸取EP管中供试品0.1ml ，进样。记录色谱图的峰面积。,供试品浓度的计算 将标1-标5按浓度-峰面积对应关系做标准曲线，将供试品峰面积带入标准曲线求出供试品浓度。,注意事项,1 此实验过程中应注意进样量的一致，因此，采用注射过量的样品体积，通过进样环（loop）来定量进样。 2如果出现色谱峰分离不完全的现象，则可以通过调整色谱柱的长度，调整流动相中甲醇和水的比例，以改善分离效果，使杂质峰和样品峰完全分离。,思考题,1我们欲每次进样20ul，为何却要进样100ul？ 为什么测定扑热息痛片剂中的对乙酰氨基酚时需要长时间水解？ 请简述高效液相色谱仪的主要结构（图解也可）。,
