1、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支， 营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。,器材准备,Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) - workflow, culture media preparation, isolated culture of bacteria, pure culture of bacteria, morphological examination of bacteria, biochemisty, mobili
2、ty, SCT & AST of bacteria, serologic test, results analysis paper writing,医学微生物学实验 综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五） 细菌的糖发酵试验 抗菌素敏感性试验 血浆凝固酶试验 半固体接种法,糖发酵试验 Sugar Fermentation Test,不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。 糖发酵管:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等。 指示剂：溴甲酚紫，PH6.8为紫色，5.2为黄色。 原理：多糖单糖酸性产物 pH指示剂呈酸性变色
3、。 若有气体气泡。 结果:培养基变黄色无气泡“+” ，培养基变黄色有气泡“”，培养基不变色“-”。 应用:观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。,甲紫黑葡萄糖 乙紫黑乳糖 丙粉红葡萄糖 丁戊粉红乳糖,3724小时,细菌的糖发酵试验,食指垫在糖发酵管液面上方23cm处，用砂轮切割一道切痕。,两手握住发酵管切痕的两端，切痕线向外，两个大拇指抵住切痕的背面，用力将管子向里一扳，利用弯和拉的合力，将管子掰断。管口烧灼灭菌。,接种针针尖斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。退出接种针，烧灼灭菌。,管口朝向相同，放置在平皿内。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲
4、 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,小组实验分工,甲紫黑菌苔Atropurpureus 葡萄糖Glucose 乙紫黑菌苔Atropurpureus 乳糖Lactose 丙粉红菌苔Pink 葡萄糖Glucose 丁粉红菌苔Pink 乳糖Lactose,抗菌素敏感性试验 Antibiotic Susceptibility Test,Fleming and Penicillin,磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1928年发现，1941年冬首次临床应用，1945年普遍应
5、用。 我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房抗菌素使用率达100%。,为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用药，导致耐药性细菌的增多、菌群失调等问题的发生，用药前应该做药敏试验。 卫生部发布，2012年8月1日起实施的抗菌药物临床应用管理办法，规定特殊使用级抗菌药物不得在门诊使用。半年之后，医院抗菌素使用率普降一半。,纸片扩散法 Disc Agar Diffusion Method 将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。,依抑菌
6、圈的大小、有无判断敏感性。 敏感（Sensitive ）：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。 耐药（Resistant ）：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治愈。 试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,方法步骤,甲金黄菌液 乙白色菌液 丙紫黑菌液 丁粉红菌液,实验分工,安全警告：步骤的操作必须逐个完成，手上不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染。,先取菌液36ul,沿平板直径拉一条细菌接种线。,再取菌液1次,旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”。,然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板。,
7、旋转平板90度角，二次密集划线。,旋转平板90度角，三次密集划线。,旋转平板90度角，四次密集划线。,设计三点，呈等边三角距离，点距离平板边缘约15mm。 作标记：青霉素、头孢曲松、庆大霉素。 镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰消毒。 371824小时培养，观察结果。,设三点,呈等边三角距离。,点距离平板边缘约15mm。,作标记：青、头、庆,镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。,凝固酶试验 Coagulase Test,致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块。
8、 取二滴兔血浆(rabbit plasma)置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约23个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径810mm的一层薄菌膜 ，立即观察结果。 菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。 白色菌苔容易涂抹均匀，金黄色菌苔凝固涂抹不开。 来回侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。,研磨成直径810mm的一层薄菌膜。,半固体穿刺接种法 Stab Semisolid Method,具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈根须状或云雾状混浊状态。,无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘
9、清晰，周围培养基清澈透明。,电镜,半固体,371824小时,接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。,管口、接种针经火焰烧灼灭菌。,甲紫黑, 乙紫黑； 丙粉红, 丁戊粉红。 标记:组号,颜色。,半固体穿刺接种法,本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）操作，可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐稳，很专注，不分心，在火焰周围
10、1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话，以免感染病原菌。,生物安全警告 BIOHAZARD,细菌的糖发酵试验P16 甲紫黑葡萄糖 乙 紫黑乳糖 丙粉红葡萄糖 丁 粉红乳糖 细菌的药敏试验P20 甲金黄菌液平板 + 青、链、庆纸片 乙白色菌液平板 + 青、链、庆纸片 丙紫黑菌液平板 + 青、链、庆纸片 丁粉红菌液平板 + 青、链、庆纸片 血浆凝固酶试验P17 兔血浆15ul+金黄色,白色 半固体接种法P11 甲紫黑， 乙紫黑， 丙粉红， 丁粉红。,思考题,细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 为什么要在发酵管液面上方大约23cm处切割？ 培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？
11、 抗菌素敏感性实验有何实际意义? 血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么? 半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照?,糖发酵管管底一侧稍微垫高！,微量发酵管管口朝下， 37培养1824小时。,试管用毛刷，上下、旋转刷洗内壁和管底。,字迹用湿纱布，粘去污粉擦拭。,管口朝向相同，流水冲洗10次。,洗干净的试管，倒扣在筐内，晾干。,平皿用纱布，旋转擦拭内外侧，字迹用纱布粘去污粉擦拭。,流水冲洗10次。逐个倒扣在筐内，晾干。,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,power socket test tube rack Alcohol burner kidney basin,test tube rack inoculating needle , inoculating loop ； oil base pen , lighter.,实验器材 整齐有序,
