1、最佳的基因表达体系：目的基因的最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。活性高和表达产物容易分离纯化。宿主细胞是基因克隆中重组宿主细胞是基因克隆中重组DNADNA分子的繁殖场所，适当分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：的宿主细胞，必须符以下条件：容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；容易进行
2、容易进行DNADNA技术操作；技术操作；产物的产量、产率高，且易提取纯化。产物的产量、产率高，且易提取纯化。原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞宿主细胞的种类宿主细胞的种类主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。缺点：只能作抗原用。非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的以真核蛋白的mRNAmRNA的的AUGAUG为起始，在其氨基为起始，
3、在其氨基端不含细菌多肽序列。端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：易被蛋白酶破坏。优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；氨酸残基；缺点：产量不高，缺点：产量不高，信号肽不被切割信号肽不被切割枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌酵母酵母丝状真菌丝状真菌 哺乳动物细胞哺乳动物细胞什么是什么是包涵体？包涵体？不含抗性标记抗不含抗性标记抗生素平板培养基生素平板培养基10-12h10-12h100100个菌落个菌落含抗性标记抗生含抗性标记抗生素平板培养基素平板培养基 10-12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数
4、重复三次重复三次,计算比值计算比值 (稳定性稳定性)二、基因工程菌的发酵工艺二、基因工程菌的发酵工艺1 1、培养基的影响、培养基的影响u碳源碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多。副产物较多。u葡萄糖葡萄糖对对laclac启动子有阻遏作用启动子有阻遏作用,采用流加措施采用流加措施,控制培养控制培养液中葡萄糖的较低浓度液中葡萄糖的较低浓度,可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。基因工程药物（生物技术）的特
5、点基因工程药物（生物技术）的特点（3 3）生产工艺和条件：）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4 4）初始物料的物理、化学和生物学特性：）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、度、pHpH、黏度、流体力学性质和热力学性质。、黏度、流体力学性质和热力学性质。2 2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结
6、构、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。度、分配系数、挥发性、吸附性能等。3 3、目的产物特性、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等
7、。活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4 4、产品质量的要求、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。定性等。（1 1）细胞收集：离心和膜过滤）细胞收集：离心和膜过滤（2 2）细胞破碎：）细胞破碎：机械法机械法-高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法非机械法-酶溶
8、、化学渗透、热处理、渗透压冲击酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。法。（3 3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。心和膜过滤。1 1、细胞破碎与固液分离、细胞破碎与固液分离分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术（分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术（离子离子交换层析交换层析、反相色谱反相色谱、亲和层析亲和层析、凝胶过滤凝胶过滤等）。等）。2 2、目的产物的分离纯化、目的产物的分离纯化（3 3）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；生物学特性；（4 4）阐明
9、载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状）阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；胞与载体结合后的遗传稳定性；（5 5）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。达的方法及水平等。（2 2）原始种子批须确证克隆基因）原始种子批须确证克隆基因DNADNA序列，详细叙述种子
10、批序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性；载体表达系统的稳定性；（3 3）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；材料，并控制微生物污染；（4 4）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；（5 5）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿
11、主细胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞-载体稳定性载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品；统和产品；（6 6）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的特）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。插入基因载体的酶切图谱等。1 1、产品的鉴别、产品的鉴别表表4-3 4-3 重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法四、目标产品的质量控
12、制四、目标产品的质量控制（1 1）肽图分析法）肽图分析法（2 2）氨基酸成分分析）氨基酸成分分析（3 3）部分氨基酸序列分析：）部分氨基酸序列分析：N-N-端端1515个氨基酸个氨基酸（4 4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定（5 5）蛋白质二硫键分析）蛋白质二硫键分析2 2、纯度分析、纯度分析（1 1）目的蛋白质含量测定）目的蛋白质含量测定（2 2）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。见表）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。见表4-44-43 3、生物化学测定、生物化学测定4 4、稳定性考察、稳定性考察5 5、产品一致性的保证、产品一致性的保证（4
13、 4）加保护剂保存：）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。2 2、固态保存、固态保存 一般蛋白质含水量超过一般蛋白质含水量超过10%10%时容易失活。时容易失活。含水量降到含水量降到5%5%时，在室稳或冰箱中保存均比较稳定，时，在室稳或冰箱中保存均比较稳定，3737保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。制成干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在44可保存相当长的时间。可保存相当长的时间。例如：专利技术生产重组类人胶原蛋白，采用瑞士例如：专利技术生产重组类人胶原蛋白，采用瑞士比欧生物工程公司的发酵灌成套设备，严格按比欧生物工程公司的发酵灌成套设备，严格按GMPGMP标标准生产，准生产，年产年产100100公斤医用级人胶原蛋白纯品，公斤医用级人胶原蛋白纯品，100100吨化妆品级胶原蛋白水溶液（吨化妆品级胶原蛋白水溶液（1%1%），产品可供医药），产品可供医药和医疗器械诸如可注射产品、创伤等药物以及化妆和医疗器械诸如可注射产品、创伤等药物以及化妆美容产品、保健食品大量之需。美容产品、保健食品大量之需。
