1、1.1.11.1.1基因工程的发展历程和工具基因工程的发展历程和工具甲生物甲生物乙生物乙生物取出优取出优秀基因秀基因“剪切剪切”“拼接拼接”新类型新类型表达表达新的生物产品新的生物产品基基因因敲敲除除技技术术转转基基因因技技术术生物生物新类型新类型敲敲除除不不利利基基因因新的生物产品新的生物产品 又叫基因拼接技术或又叫基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术。指。指在在体外体外通过通过人工人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”等方等方法，对生物的基因进行法，对生物的基因进行改造和重新组合改造和重新组合，然后导入受体细胞，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体并使重组基因在受体细胞中表达细胞中表达，产
2、生人类需要的基因产物的，产生人类需要的基因产物的技术。技术。基因工程，又叫基因工程，又叫DNA重组技术。是指重组技术。是指按照人们的愿望，按照人们的愿望，在在DNA分子水平上进行分子水平上进行严格的设计严格的设计，并通过体外，并通过体外DNA重组和转基重组和转基因技术，因技术，赋予生物以新的遗传特性赋予生物以新的遗传特性，从而，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。生物产品。获得获得人类所需的基因产物人类所需的基因产物 结结 果果 剪切、拼接、导入、表达剪切、拼接、导入、表达基本过基本过程程 DNADNA分子水平分子水平操作水操作水平平 基基 因
3、因操作对操作对象象 生物体外生物体外操作环操作环境境基因拼接技术、基因拼接技术、DNADNA重组技术重组技术等等 别别 名名在基因工程诞生的道路上，出现那些理在基因工程诞生的道路上，出现那些理论基础和技术呢？论基础和技术呢？生物化学生物化学分子生物学分子生物学微生物学微生物学催生催生1、DNA是遗传是遗传物质的证明物质的证明（艾艾弗里弗里）科技探索之路科技探索之路（一）基因工程的理论发展（一）基因工程的理论发展1 9 4 3 美美 Avery 肺炎肺炎双球菌的转双球菌的转化实验等。化实验等。梅塞尔松、斯塔尔梅塞尔松、斯塔尔沃森、克里克沃森、克里克2、DNA双螺旋结构双螺旋结构 和中心法则的确立
4、和中心法则的确立中心法则中心法则科技探索之路科技探索之路3、遗传密码的破、遗传密码的破译译遗遗 传传 密密 码码 表表科技探索之路科技探索之路、基因转移载体的发现、基因转移载体的发现 基因是可以转移的。基因是可以转移的。质粒质粒（二）基因操作的技术发明（二）基因操作的技术发明、工具酶的发明、工具酶的发明基因是可切割的。基因是可切割的。限制性限制性 内切酶内切酶、DNA合成合成和和测序技术的发测序技术的发明明DNADNA合成合成仪仪、DNADNA体外重体外重组的实验组的实验伯伯格格科技探索之路科技探索之路5、1988年，年，美美 K.Mullis发明发明PCR技术技术6、第一例转基因动物和转基因
5、植物问世、第一例转基因动物和转基因植物问世1980 科学科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。烟草。实现了一种生物实现了一种生物的某些性状在另一的某些性状在另一种生物中表达；种生物中表达；问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可苏云金芽孢杆菌含有一种可以合以合成毒蛋白的基因。让细菌的成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋毒蛋白基因在棉花细胞中表达，白基因在棉花细胞中表达，可培可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪
6、些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花普通棉花(无抗虫特无抗虫特性性)苏云金芽孢杆苏云金芽孢杆菌菌提提取取抗虫基抗虫基因因通过运载体导入通过运载体导入转基因棉花含转基因棉花含抗虫基抗虫基因因转基因棉花有转基因棉花有抗虫抗虫特性特性基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内杆菌细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“缝缝合
7、合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内限制性核酸内切酶切酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连连接酶接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体思考：思考：自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNADNA进入另一生物的情进入另一生物的情况？况？动物容易让外来动物容易让外来DNADNA侵入自身而得以遗传吗？侵入自身而得以遗传吗？为什么？为什么？单细胞生物，容易遭到入侵吗？单细胞生物，容易遭到入侵吗？单细胞生物并没有
8、在进化中灭绝，而是产生了一些单细胞生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身并将其分解，而对自身的的DNA不能起作用。不能起作用。一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”主要来源：主要来源：种类与命名：种类与命名：作用特点：作用特点：4.4.限制酶识别序列限制酶识别序列:5.5.作用结果：作用结果：识别识别特定核苷酸序列特定核苷酸序列产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端,切断切断磷酸二酯键磷酸二酯键具有具有特异性特异性。一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能
9、识别一种特特定的定的核苷酸序列核苷酸序列，并且能在，并且能在特定的切点特定的切点上上切割切割DNADNA分子分子大多数大多数限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由6 6个个核苷酸组成核苷酸组成少数的少数的识别序列由识别序列由4 4、5 5或或8 8个个核苷酸组成核苷酸组成种类与命名：现在已经从约现在已经从约300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶种限制性内切酶(限制酶限制酶)。EcoRSma粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌（Escherichia coli R）练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d菌株菌株(Ha
10、emophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3种限制酶，则种限制酶，则分别命名为分别命名为:Hind、Hind和和Hind磷酸磷酸二酯键二酯键识别识别DNADNA特定的序列特定的序列,使使DNADNA分子链的固定部分子链的固定部位分开。位分开。.黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末
11、端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两者的黏，然后让两者的黏性性(平平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。分子了。二、“分子缝合针”DNA连接酶作用作用:把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将，即将脱氧核糖和磷酸连接起来脱氧核糖和磷酸连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形催化磷酸二酯键形成成 可把黏性末端之间
12、的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA连接酶连接酶还可把平末端之间的缝隙还可把平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低类型：类型：EcoliDNA连接连接酶酶T4DNA连接酶连接酶来源来源功能功能大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体恢复恢复磷酸磷酸二酯键二酯键只能连接黏性末端只能连接黏性末端能连接黏性末端和能连接黏性末端和平末端平末端(效率较低效率较低)相同点相同点差别差别DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNADNA聚合酶聚合酶D
13、NADNA连接酶连接酶化学本质化学本质作用部位作用部位模板模板蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质磷酸二酯键磷酸二酯键（单个脱氧单个脱氧核苷酸核苷酸+片片段段）磷酸二酯键磷酸二酯键（DNADNA双链片段双链片段+DNA+DNA双链片段）双链片段）需要（需要（DNADNA一条链）一条链）不需要不需要“分子运输车分子运输车”质粒质粒质粒：裸露、结构简单、质粒：裸露、结构简单、独立于细菌染色体之外，独立于细菌染色体之外，具有自我复制能力的双具有自我复制能力的双链链环状环状DNADNA分子分子。插入基因终止子终止子标记基因标记基因复制原点复制原点启动子启动子RNARNA聚合酶聚合酶识别和结识别和结合部位，合部位，
14、驱动基因驱动基因转录出转录出mRNAmRNA。鉴别受体细胞是鉴别受体细胞是否含有目的基因。否含有目的基因。转录转录停止停止的位的位置。置。三、运载体（运载工具）载基因进入受体细胞 例：例：质粒，质粒，噬菌体，动、植物病毒。噬菌体，动、植物病毒。1 1、分子量相对较小，分子量相对较小，至少有至少有一个（多个）限一个（多个）限制酶切割位点制酶切割位点，供外源，供外源DNADNA片段插入其中。片段插入其中。2 2、重组运载体进入受体细胞后（或整合到染、重组运载体进入受体细胞后（或整合到染色体、色体、DNADNA上），上），在受体细胞存在并进行自在受体细胞存在并进行自我复制我复制。3 3，有特殊的遗传
15、标记基因有特殊的遗传标记基因，如抗四环素、氨，如抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组苄青霉素等标记基因，供重组DNADNA的鉴定和的鉴定和选择。选择。DNADNA重组技术重组技术的三件工具：的三件工具：限制性内切酶、限制性内切酶、DNADNA连接酶、连接酶、运载体。运载体。总总结结质粒质粒目的基因目的基因限制限制性内性内切酶切酶连接连接酶酶重组质重组质粒粒1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术生物技术基因工程，实施该工程的最终基因工程，实施该工程的最终目的是（目的是（）A.定向提取生物体定向提取生物体DNA分子分子 B.定向地对定向地对DNA分
16、子进行分子进行“剪切剪切”C.定向地改造生物的遗传性状定向地改造生物的遗传性状 D.在生物体外对在生物体外对DNA分子进行改造分子进行改造练习巩固练习巩固2、下列哪项不是基因工程中经常使用的用来、下列哪项不是基因工程中经常使用的用来运载目的基因的载体运载目的基因的载体()A.细菌质粒细菌质粒 B.噬菌体噬菌体 C.动植物病毒动植物病毒 D.细菌核区的细菌核区的DNA 3、限制酶在、限制酶在DNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNA切开切开吗？以下是吗？以下是四种四种不同限制酶切割形成的不同限制酶切割形成的DNA片片段段,你能用你能用DNA连接酶将它们连接起来吗？连接酶将它们连接起来吗？CTG
17、CA G G ACGTC AC TGGC CG G CTTAA GC CGGT CA AATTC G 4、在基因工程中，切割运载体和含有目的基、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因因的的DNA片段，需使用（片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶A5.不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是()A、能复制、能复制 B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD本节内容小结：本节内容小结：1.知识梳理：知识梳理：DNA重组技术的基本工具
18、：重组技术的基本工具：限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸之间的磷酸二酯键；之间的磷酸二酯键；基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：最常用的是细菌质粒，还有最常用的是细菌质粒，还有噬菌体的衍生物、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。动植物病毒等。2.方法、技巧、规律总结：方法、技巧、规律总结：限制酶切割的是磷酸二酯键，而限制酶切割的是磷酸二酯键，而DNA连接酶连连接酶连接的正是两个断开此键的接的正是两个断开此键的DNA片段。片段。“分子运分子运输车输车”是目的基因进入受体细胞的载体，它具是目的基因进入受体细胞的载体，它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、表达的有的若干特点是基因工程鉴定、选择、表达的关键，可以说，没有它，目的基因即使进入受关键，可以说，没有它，目的基因即使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不上复制和表体细胞，也难以稳定保存，更谈不上复制和表达。达。3.思维误区提示：思维误区提示：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶根本不是同类酶，其聚合酶根本不是同类酶，其功能特点大不相同，注意其区别。功能特点大不相同，注意其区别。
