1、临床基因扩增检验培训班临床基因扩增检验培训班PCR污染与预防污染与预防临床基因扩增临床基因扩增检查验收中存在的问题检查验收中存在的问题 5份标本份标本(2份标本小于最低检测限份标本小于最低检测限)检测结果检测结果:(1)与预期靶值完全符合与预期靶值完全符合(2)阴性对照出现阳性，阴性对照出现阳性，小于最低检测限的标本小于最低检测限的标本为阳性为阳性(3)阳性标本高于预期值阳性标本高于预期值2个数量级个数量级.(4)所有阳性标本均低于预期靶值所有阳性标本均低于预期靶值1个及以上数量个及以上数量级级.聚合酶链式反应聚合酶链式反应成功的关键因素成功的关键因素 保证标本质量与模板质量保证标本质量与模板
2、质量 PCR反应体系与反应条件的优化反应体系与反应条件的优化 PCR相关仪器的校准相关仪器的校准 灵敏度、特异性灵敏度、特异性 批内与批间检测的可重复性批内与批间检测的可重复性 预防污染的发生预防污染的发生(假阳性假阳性)Stephen AB et al.Real-time reverse transcription PCR(qRT-PCR)and its potential use in clinical diagnosis.Clinical Science (2005)109,365379标本质量与模板质量标本质量与模板质量Real time PCR，2006 认真分析标准曲线观察认真分析
3、标准曲线观察PCR反应反应体系与反应条件是否正确体系与反应条件是否正确1.相关系数（相关系数（r2）：越接近）：越接近1越好越好2.斜率（斜率（slope）：）：-3.13.6（100%的扩增效率）的扩增效率）3.截距（截距（intercept）：）：33.336.5（100%的扩增效率）的扩增效率）Ct=A+BlgCCt3733123斜率斜率=-3.5斜率斜率=-2.0标准曲线的要求标准曲线的要求扩增效率：通常要求达到扩增效率：通常要求达到90%100%，如小于如小于90%，必须重新优化。对应的，必须重新优化。对应的斜率斜率10（-1/斜率）斜率）-1为为-3.1-3.6。截距（灵敏度）：截
4、距（灵敏度）：33.336.5（100%效率）效率）相关系数：检测标准品稀释的相关系数：检测标准品稀释的准确性与加样的准确性（准确性与加样的准确性（0.99）Real time PCR，2006 斜率增加：斜率增加：（1）标准品为非线性的质粒。）标准品为非线性的质粒。（2）反应体系与反应条件未优化好。）反应体系与反应条件未优化好。（3）存在）存在Taq酶的抑制剂或酶的抑制剂或Taq酶的活性下降。酶的活性下降。（4）加样不准确）加样不准确斜率降低：污染或加样不准确。斜率降低：污染或加样不准确。截距增加：截距增加：（1）标准品的浓度不正确。）标准品的浓度不正确。（2）标准品降解（反复冻融或未加载体
5、）标准品降解（反复冻融或未加载体DNA的低的低浓度标准品）浓度标准品）截距降低：截距降低：（1）标准品的浓度不正确。）标准品的浓度不正确。（2）污染。）污染。PCR相关仪器的校准相关仪器的校准批内与批间检测的可重复性批内与批间检测的可重复性TBDNA（+）污染污染 方法本身？方法本身？实验人员？实验人员？实验场地？实验场地？实验试剂？实验试剂？聚合酶链式反聚合酶链式反应与诺贝尔化应与诺贝尔化学奖学奖美国科学家美国科学家Kary B.Mullis Kary B.Mullis与与 聚合酶链式聚合酶链式反应反应“我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情享受生活的年
6、龄及时地把诺贝尔奖授予给我享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我”PCR的污染源的污染源 交叉污染。交叉污染。来自试验材料来自试验材料。“遗留遗留”(carryover)污染。污染。PCR去污染（去污染（decontamination）的措施的措施 停止试验，寻找污染源。停止试验，寻找污染源。抛弃所有可疑的试剂。抛弃所有可疑的试剂。工作区间彻底的清洁消毒。工作区间彻底的清洁消毒。更换实验设备。更换实验设备。改用另一对引物，扩增靶改用另一对引物，扩增靶DNA的不同的不同区域。区域。PCR的基本步骤与污染的发生的基本步骤与污染的发生 Reagent preparation Specimen pre
7、paration Amplification Detection Results Calculation预防污染的措施预防污染的措施 建立标准的建立标准的PCR实验室，将实验室，将PCR的不同过的不同过程在不同的区间进行。为污染控制策略的程在不同的区间进行。为污染控制策略的核心部分核心部分。酶法防止酶法防止PCR产物的遗留污染。产物的遗留污染。表面紫外线照射减少表面紫外线照射减少PCR的污染。的污染。用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链DNA衍生化，这些加合物可防止污染的衍生化，这些加合物可防止污染的DNA作为反应的底物。作为反应的底物。标准实验室的组成及其
8、功能（标准实验室的组成及其功能（1）前前PCR区（区（Pre-PCR laboratory）：又称）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制装、贮存以及配制PCR反应的反应的“主混合物主混合物”Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 标 记 的 引 物 和和 或或 和和主混合物主混合物 标本处理区（标本处理区（Sample processing laboratory）：标本的保存，目的核酸的提）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及取
9、、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合的合成。成。Mn2+AmpEraserTth DNAPolymeraseBiotinylatedPrimersTarget RNA or DNAReverseTranscriptiondCTPdTTPdGTPdUTPdATPBiotinylatedAmpliconBiotinylatedAmplicon标准实验室的组成及其功能标准实验室的组成及其功能 PCR扩增区（扩增区（PCR amplification laboratory）：）：DNA或或cDNA的扩增。的扩增。PCR产物分析区（产物分析区（PCR product analysis laborato
10、ry）：又称后）：又称后PCR区，区，PCR产物产物的检测与分析。的检测与分析。Step 2.Denaturation and HybridisationDenaturationBSABSAAMPLICONAMPLICONDenatured StrandsBiotin HybridisationCapture Probe linked to BSAStep 3.Binding of a Av-HRP Conjugate and Addition of Substrate(Incubate at 37 C)Capture ProbeMagnetic MicroparticlesAvidin-ho
11、rseradish Peroxidase ConjugateBiotinAmpliconTetramethylbenzidine(TMB)SubstrateMMPMMPTMBHydrogenPeroxideoStep 4.Stop Solution Addition and Absorbance MeasurementAdd Stop Solution and Measure AbsorbanceCaptureProbeMicrowell PlateAddition of SubstrateTetramethylbenzidine(TMB)SubstrateBiotinBSAAMPLICONB
12、SAAMPLICONHydrogenPeroxideAvidin-horseradish peroxidase(Av-HRP conjugate)标准实验室的基本规章制度标准实验室的基本规章制度 所有进入实验室的人都要遵守该制所有进入实验室的人都要遵守该制度。度。明确试验目的是否与实验室功能一致。明确试验目的是否与实验室功能一致。明确试验中的不确定因素。明确试验中的不确定因素。物流和人流物流和人流 单向流动的原则。单向流动的原则。从从“干净干净”的实验室到的实验室到“脏脏”的实验室的实验室工作服工作服(1)在实验室指定区域内更换指定的工作服。在实验室指定区域内更换指定的工作服。(2)实验室中应
13、频繁更换手套。实验室中应频繁更换手套。(3)一次性实验室用品一次性实验室用品(包括一次性手套与鞋包括一次性手套与鞋套套)应丢弃到生物危险废料容器中。应丢弃到生物危险废料容器中。(4)工作衣不能穿出指定的实验室外。工作衣不能穿出指定的实验室外。实验室卫生实验室卫生 实验室设备必要时应用实验室设备必要时应用10%漂白剂清洗。漂白剂清洗。所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒后方能丢弃后方能丢弃。防护罩防护罩/超净工作台超净
14、工作台 工作前，工作台表面应用工作前，工作台表面应用75%酒精擦拭台酒精擦拭台面，紫外灯消毒，面，紫外灯消毒，工作后，把物品移出，用工作后，把物品移出，用75%酒精擦拭台酒精擦拭台面，并打开紫外灯消毒。面，并打开紫外灯消毒。几点建议几点建议(1)所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌的管子与瓶子的管子与瓶子(2)每次实验应设阴性对照每次实验应设阴性对照.(3)将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，标准品的稀释标准品的稀释(管子离心后管子离心后5min打开打开,以避免气溶以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳
15、性对照胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照)(4)正确使用微量加样器正确使用微量加样器(5)定期用定期用10%的次氯酸钠清洁微量加样器与工作的次氯酸钠清洁微量加样器与工作台面台面(6)换气设备应正常工作换气设备应正常工作.三、酶法防止三、酶法防止PCR产物产物的遗留污染的遗留污染 限制性核酸内切酶法。限制性核酸内切酶法。修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。UNG消解法消解法UNG消解法消解法原理原理 1）在）在PCR反应体系中加入反应体系中加入UNG，并用，并用dUTP替代替代dTTP，扩增产物含有，扩增产物含有dUTP。2）UNG可以去除遗留污染可以去除遗留
16、污染DNA中的中的dU，DNA聚合酶会在这些位点处停滞。聚合酶会在这些位点处停滞。3）无）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。生断裂。以以dUTP替代替代dTTP的的PCR扩增扩增产物，产物，“”表示表示dUTP再次扩增，扩增体系加入再次扩增，扩增体系加入UNG，37度度10分，可消去分，可消去dU。95度度10分钟，分钟，DNA在无在无dU的区域断裂，的区域断裂，因此遗留的因此遗留的DNA不能被扩增不能被扩增UNG消解法消解法的的缺点缺点 短于短于100bp的的PCR产物不能用产物不能用UNG完完全消除污染，全消除污染，四、表面紫外线照射减少四、
17、表面紫外线照射减少PCR污染污染的原理的原理 紫外线紫外线(Ultraviolet、UV)诱导诱导DNA的损伤的损伤是通过在相邻的嘧啶碱基是通过在相邻的嘧啶碱基(CT、TT、TC、CC)之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合酶介导的链延伸反应。酶介导的链延伸反应。变性变性退退火火535355533紫外线照射紫外线照射延伸延伸5533 特特 点点 需要较长的时间，不能消除所有污染，需要较长的时间，不能消除所有污染，对序列长度有一定的依赖性，当对序列长度有一定的依赖性，当DNA片片段小于段小于30
18、0bp时效果较差。时效果较差。被消毒表面应与被消毒表面应与UV光源垂直以达到最大光源垂直以达到最大的光强度。的光强度。靶分子被遮蔽，则失活效率不高。靶分子被遮蔽，则失活效率不高。UV照射具有致突变性，并可引起视力下照射具有致突变性，并可引起视力下降或致盲。降或致盲。去污染方法去污染方法 紫外灯在工作区不使用的所有时间内始终紫外灯在工作区不使用的所有时间内始终打开。打开。使用后将紫外灯打开以消除工作空间的污使用后将紫外灯打开以消除工作空间的污染。再次准备工作之前再将紫外灯关掉。染。再次准备工作之前再将紫外灯关掉。紫外线照射时间依具体情况而定。紫外线照射时间依具体情况而定。结结 论论 紫外线照射是其他适当技术的辅助手段紫外线照射是其他适当技术的辅助手段.，为保持为保持PCR实验室的无污染提供额外的安实验室的无污染提供额外的安全保证。全保证。
