1、所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。宿主的。因为：因为：过去过去5050年内，这种细菌在基础研究中一直扮年内，这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色；演着中心角色；已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识；化学和遗传学知识；事实上所有关于基因结构和功能的基础研究事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。都是以大肠杆菌为材料而开展的。3.1.3 pBR3223.1.3 pBR322的家谱的家谱pBR322pBR322作为一个克隆载体的方便性决非偶然，作为一个克隆载体的
2、方便性决非偶然，它在被设计时就定好了要拥有这些特点。它在被设计时就定好了要拥有这些特点。构建构建pBR322pBR322的步骤简述如图。的步骤简述如图。它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了全它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技术。部巧妙的基因操作技术。pBR322pBR322实际上由实际上由3 3个在自然界存在的天然质粒拼个在自然界存在的天然质粒拼接而成。接而成。3.1.4 3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载体其他大肠杆菌质粒克隆载体pBR322pBR322质粒是在质粒是在2020世纪世纪7070年代后期被构建出来年代后期被构建出来的，第一份描述它的用途的论文在的，第一
3、份描述它的用途的论文在19771977发表。发表。从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载体，它们大多数只是对体，它们大多数只是对pBR322pBR322作了少量修改。作了少量修改。pBR327pBR327一个高拷贝数质粒一个高拷贝数质粒pBR327pBR327通过从通过从pBR322pBR322中移除一个长中移除一个长1 089bp1 089bp的片的片段而构建。片段的删除并没有损伤段而构建。片段的删除并没有损伤ampampR R和和terterR R这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力和接合能力。和接合能力。p
4、BR327pBR327与与pBR322pBR322有两点重要的不同有两点重要的不同 (1)pBR327(1)pBR327的拷贝数比的拷贝数比pBR322pBR322更高更高。每个大肠杆菌中可以存在每个大肠杆菌中可以存在30-4530-45个质粒分子。个质粒分子。当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候，当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候，有更高拷贝数的有更高拷贝数的pBR327pBR327就更适合于用作载体。就更适合于用作载体。拷贝数越高，被克隆的基因在细胞中所产生的拷贝数越高，被克隆的基因在细胞中所产生的效果就越容易被发现。效果就越容易被发现。(2)1 089bp(2)1 089bp片
5、段的删除，破坏了片段的删除，破坏了pBR322pBR322的接合的接合能力，使能力，使pBR327pBR327不能把自己转移到另外一个不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去大肠杆菌细胞中去。这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。出。相反，相反，pBR322pBR322在理论上可以通过结合而进入天在理论上可以通过结合而进入天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上pBR322pBR322也有一定的安全措施减少这种情况的发生。也有一定的安全措施减少这种
6、情况的发生。当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选择择pBR327pBR327。pUC8pUC8乳糖选择质粒乳糖选择质粒pUC8pUC8也是一个源自于也是一个源自于pBR322pBR322的质粒，的质粒，只保留了只保留了pBR322pBR322的复制起点和的复制起点和ampampR R基因。基因。ampampR R基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一的限制性酶切位点。一的限制性酶切位点。所有这些位点被集中到所有这些位点被集中到pUC8pUC8所携带的所携带的lacZlacZ 基因基因中的一小段序列上。中的一小段序列
7、上。pUC8pUC8所拥有的所拥有的3 3个优点使它成为最受欢迎的大肠个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。杆菌克隆载体之一。第一个优点第一个优点人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内的拷贝数达到了的拷贝数达到了500-700500-700（扩增以前的数目）。（扩增以前的数目）。这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的的目的DNADNA。第二个优点第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅在于重组体的识别只需一步，仅仅只要把待
8、筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青霉素和霉素和X-galX-gal的琼脂培养基上。的琼脂培养基上。而而pBR322pBR322和和pBR327pBR327，重组体的筛选都需要把菌，重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗生素培养基平板。生素培养基平板。一个用一个用pUC8pUC8做载体的克隆实验比选择做载体的克隆实验比选择pBR322pBR322和和pBR327pBR327要节约一半的时间。要节约一半的时间。第三个优点第三个优点是是pUC8pUC8拥有拥有多克隆单酶切位点多克隆单酶切位点，这使有两个不同
9、黏性末端的这使有两个不同黏性末端的DNADNA片段片段(比如一端比如一端是被是被EcoEcoRIRI酶切过的，另一端是被酶切过的，另一端是被BamBamHIHI酶切酶切过的过的)可以直接被克隆，而不需求助于加入连可以直接被克隆，而不需求助于加入连接片段的操作。接片段的操作。其他的其他的pUCpUC载体，载体，拥有不同的限制性酶切位点，拥有不同的限制性酶切位点，具有更大的灵活性，允许更多种不同的具有更大的灵活性，允许更多种不同的DNADNA片片段被克隆。段被克隆。此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在于此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在于M13mp M13mp 系列载体中的限制性酶切位点一样
10、，系列载体中的限制性酶切位点一样，可以很方便的进行可以很方便的进行DNADNA测序或体外诱变。测序或体外诱变。pGEM3ZpGEM3Z克隆克隆DNADNA的体外转录的体外转录pGEM3ZpGEM3Z与与pUCpUC载体很相似：都含有载体很相似：都含有ampampR R和和lacZlacZ基因，在后者上有一个限制性酶切位基因，在后者上有一个限制性酶切位点，而且两个质粒有着差不多完全相同的大点，而且两个质粒有着差不多完全相同的大小。小。区别：区别：pGEM3ZpGEM3Z多两个短片段，每一个片段都可多两个短片段，每一个片段都可以充当启动子，黏附以充当启动子，黏附RNARNA聚合酶。聚合酶。外源外源
11、DNADNA在限制性酶切位点被导入在限制性酶切位点被导入pGEM3ZpGEM3Z载体，载体，在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个启动子序列。这就意味着，在试管里同时放启动子序列。这就意味着，在试管里同时放入重组后的入重组后的pGEM3ZpGEM3Z质粒和提纯的质粒和提纯的RNARNA聚合酶，聚合酶，被克隆的被克隆的DNADNA分子会指导合成相应的分子会指导合成相应的RNARNA，发，发生转录。产生的生转录。产生的RNARNA可用作杂交探针，也可用可用作杂交探针，也可用于研究于研究RNARNA加工加工 (如内含子如何切除如内含子如何切除)，或是，或是用于合
12、成蛋白质。用于合成蛋白质。被被pGEM3ZpGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌是被大肠杆菌RNARNA聚合酶识别的标准启动子。聚合酶识别的标准启动子。实际上这些启动子有的被实际上这些启动子有的被T7T7噬菌体编码的噬菌体编码的RNARNA聚聚合酶专一性识别，有的被合酶专一性识别，有的被SP6SP6噬菌体编码的噬菌体编码的RNARNA聚合酶专一性识别。聚合酶专一性识别。当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这些些RNARNA聚合酶，用以转录噬菌体基因。聚合酶，用以转录噬菌体基因。之所以在体外转录系统中选择
13、病毒之所以在体外转录系统中选择病毒RNARNA聚合酶，聚合酶，是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体基因一定能够很快被转录出来，能够在每分基因一定能够很快被转录出来，能够在每分钟合成钟合成1-21-2ggRNARNA，比标准的大肠杆菌，比标准的大肠杆菌RNARNA聚合聚合酶高效得多。酶高效得多。3.2 3.2 基于基于M3M3噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体对任何克隆载体而言，最基本的要求是能够在对任何克隆载体而言，最基本的要求是能够在宿主细胞内自我复制。宿主细胞内自我复制。质粒载体很容易满足这个要求质粒载体很容易满足这个要求首先它有一个短的首先它有一个短
14、的DNADNA序列能够充当复制起点，序列能够充当复制起点，并且它复制所需要的酶也可以全部或大部分从并且它复制所需要的酶也可以全部或大部分从宿主细胞获得。宿主细胞获得。精密的构建操作，使最终形成的质粒载体如精密的构建操作，使最终形成的质粒载体如pBR322pBR322成为一个完整而具备功能的复制子。成为一个完整而具备功能的复制子。噬菌体，如噬菌体，如M13M13的复制情况的复制情况就较为复杂。就较为复杂。噬菌体的噬菌体的DNADNA分子通常带有几个为复制所必需的分子通常带有几个为复制所必需的基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基因和编码噬菌体特有的复制酶的基
15、因。因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。改变或是删除这些必需基因中的任一个，都会改变或是删除这些必需基因中的任一个，都会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。因此可供改变噬菌体因此可供改变噬菌体DNADNA分子的自由度很小，而分子的自由度很小，而通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小。以以M13M13噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆载噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。体的难度。一个正常的一个正常的M13M13噬菌体的基因组是噬菌体的基因组是6.4kb6.4kb，为紧，为紧紧挤在一起的紧挤在一起的1010个基因所占据，每一个基因
16、个基因所占据，每一个基因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有一个仅长一个仅长507bp507bp的短序列，新的的短序列，新的DNADNA必须从这必须从这里插入才不会损伤其他基因，还必须保证同里插入才不会损伤其他基因，还必须保证同样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。所以，只有一个很小的空间用于改造所以，只有一个很小的空间用于改造M13M13噬菌体。噬菌体。然而，然而，M13M13有一个很吸引人的优点：它使人们可有一个很吸引人的优点：它使人们可以获得单链的被克隆以获得单链的被克隆DNADNA。3.2.1 M13mp23
17、.2.1 M13mp2克隆载体的开发克隆载体的开发构建构建M13M13克隆载体第一步，是把克隆载体第一步，是把lacZlacZ 基因导入基因导入到噬菌体到噬菌体M13M13的短序列中。产生了的短序列中。产生了M13mplM13mpl，它，它在含有在含有X-galX-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。M13mplM13mpl的的lacZlacZ 基因上不含有任何的限制性酶切基因上不含有任何的限制性酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个GGATTCGGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成的序列。改变一个核苷酸就变成GAATTCG
18、AATTC，这是，这是EcoEcoRIRI的识别位点。这个改变是的识别位点。这个改变是用体外诱变完成的，产生了用体外诱变完成的，产生了M13mp2M13mp2克隆载体。克隆载体。M13mp2M13mp2有一个稍稍改变的有一个稍稍改变的lacZlacZ 基因基因(第六个密第六个密码子编码天冬氨酰而不是天冬氨酸码子编码天冬氨酰而不是天冬氨酸)，但转染，但转染了了M13mp2M13mp2的细胞产生的的细胞产生的-半乳糖苷酶仍然有半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。着正常的功能。M13mp2M13mp2是最简单的是最简单的M13M13克隆载体克隆载体。有。有EcoEcoRIRI黏性黏性末端的末端的DNADN
19、A片段可以插入进克隆位点，重组体片段可以插入进克隆位点，重组体可以通过在可以通过在X-galX-gal培养基上的噬菌斑得到识别。培养基上的噬菌斑得到识别。3.2.2 M13mp73.2.2 M13mp7对称的克隆位点对称的克隆位点开发开发M13M13克隆载体的下一步是在克隆载体的下一步是在lacZlacZ 基因上添基因上添加额外的酶切位点。加额外的酶切位点。通过在试管中合成一个叫做多接头通过在试管中合成一个叫做多接头(polylinker)的寡核苷酸而实现。的寡核苷酸而实现。多接头包含一系列的限制性酶切位点，有一个多接头包含一系列的限制性酶切位点，有一个EcoEcoRIRI的黏性末端。的黏性末
20、端。多接头被插入到多接头被插入到M13mp2M13mp2克隆载体的克隆载体的EcoEcoRIRI位点上，位点上，形成了一个更加复杂的载体，即形成了一个更加复杂的载体，即M13mp7M13mp7。M13mp7M13mp7有有4 4个可能的克隆位点：个可能的克隆位点：EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I和和PstPstI I。为了不完全破坏掉为了不完全破坏掉lacZlacZ基因，在设计这个多基因，在设计这个多接头时，人们使得读码框在通过多接头后没接头时，人们使得读码框在通过多接头后没发生改变。发生改变。这样，产生的这样，产生的-半乳糖苷酶虽然被改变了序列，半乳糖苷酶虽然被
21、改变了序列，但仍然有着正常的功能。但仍然有着正常的功能。用用EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I中的任意一种去酶解中的任意一种去酶解M13mp7M13mp7，整个多接头或其一部分会被切掉。，整个多接头或其一部分会被切掉。在其他在其他DNADNA存在下，有存在下，有3 3种连接可能发生：种连接可能发生：(1)(1)插入的新插入的新DNADNA，(2)(2)插入的多接头。插入的多接头。(3)(3)载体自连。载体自连。新新DNADNA的插入会阻碍的插入会阻碍-半乳糖苷酶的产生，因半乳糖苷酶的产生，因此重组体在含此重组体在含X-galX-gal的琼脂培养基上产生无色的琼脂培养
22、基上产生无色透明的噬菌斑。透明的噬菌斑。当插入的片段是多接头时，原来的当插入的片段是多接头时，原来的M13mp7M13mp7载体载体又再次形成了，噬茵斑是蓝色的。又再次形成了，噬茵斑是蓝色的。如果是载体自连，噬菌斑应该是什么颜色如果是载体自连，噬菌斑应该是什么颜色?多接头又一次显示其巧妙设计：不管用哪一多接头又一次显示其巧妙设计：不管用哪一个内切酶酶解，自连的载体都会连成有功能个内切酶酶解，自连的载体都会连成有功能的的lacZlacZ 基因，最终形成蓝色的噬菌斑。基因，最终形成蓝色的噬菌斑。因此因此，只有重组体产生无色透明的噬茵斑。只有重组体产生无色透明的噬茵斑。由于携带对称的克隆位点，无论新
23、的由于携带对称的克隆位点，无论新的DNADNA是通是通过过BamBamHIHI，SalSalI I或或PstPstI I中的哪一个酶切位点中的哪一个酶切位点插入载体，都可以用插入载体，都可以用EcoEcoRIRI从重组后的分子从重组后的分子中切除。中切除。3.2.3 3.2.3 更复杂的更复杂的M13M13载体载体越精巧的越精巧的M13M13载体有更复杂的多接头被插入到载体有更复杂的多接头被插入到lacZlacZ 基因中。基因中。M13mp8M13mp8：它是它是pUC8pUC8的对应物。和的对应物。和pUC8pUC8一样，它一样，它允许插入有不同的两个黏性末端的允许插入有不同的两个黏性末端的
24、DNADNA片段。片段。M13mp8M13mp8姐妹载体姐妹载体M13mp9M13mp9有一个相同的多接头，有一个相同的多接头，但是多接头的方向相反，这使得它有另外一但是多接头的方向相反，这使得它有另外一个优点。当把一个个优点。当把一个DNADNA片段克隆进片段克隆进M13mp8M13mp8后，后，可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然后把它连入后把它连入M13mp9M13mp9，那么这片段在载体中就，那么这片段在载体中就有了相反的方向。有了相反的方向。这个特点在这个特点在DNADNA测序中很重要，因为核苷酸序列测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的末端一
25、直读进插入的从多接头的末端一直读进插入的DNADNA片段。片段。通常通常从测序实验中只能读出约从测序实验中只能读出约600600个碱基个碱基，如果，如果插入的插入的DNADNA超过这个长度，就有一个末端的序超过这个长度，就有一个末端的序列读不出来。列读不出来。一种解决的方法就是一种解决的方法就是把把DNADNA换个方向，再插入到换个方向，再插入到姐妹载体中姐妹载体中。用这个新得到的克隆，测序实。用这个新得到的克隆，测序实验就可以得到另一端的序列。验就可以得到另一端的序列。还有其他的还有其他的M13M13载体可成对选择使用。载体可成对选择使用。与与M13mp8/9M13mp8/9很相似的有：很相
26、似的有：M13mplO/11M13mplO/11；M13mpl8/19M13mpl8/19；但是它们有不同的多接头，即，有不同的限制但是它们有不同的多接头，即，有不同的限制性酶切位点。性酶切位点。3.2.4 M133.2.4 M13和质粒的杂交载体和质粒的杂交载体尽管尽管M13M13可以产生单链可以产生单链DNADNA，这使它显得非常有，这使它显得非常有用，但它有很大一个缺点。用，但它有很大一个缺点。用用M13M13作载体时，可以容纳的作载体时，可以容纳的DNADNA片段大小非常片段大小非常有限，通常认为有限，通常认为100bp100bp是上限，特殊情况下克是上限，特殊情况下克隆的片段长度可达
27、隆的片段长度可达1kb1kb。为了解决这个问题，人们把为了解决这个问题，人们把M13M13基因组的一部分基因组的一部分和质粒和质粒DNADNA结合在一起，构建了一种新型的载结合在一起，构建了一种新型的载体，叫做噬菌体质粒体，叫做噬菌体质粒(plagemids)。pEMBL8pEMBL8是一个噬菌体质粒是一个噬菌体质粒：通过把通过把M13M13基因组中一个基因组中一个1 300bp1 300bp的片段导入的片段导入pUC8pUC8中而构建。中而构建。M13M13在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链链DNADNA变成单链变成单链DNADNA，而被导入的那一
28、段，而被导入的那一段M13 M13 DNADNA则含有被这种酶识别的信号序列。则含有被这种酶识别的信号序列。虽然这段序列从虽然这段序列从M13M13的基因组中被分离出来，但的基因组中被分离出来，但功能仍然还在。功能仍然还在。所以，所以，pEMBL8pEMBL8也可以被转化成单链的也可以被转化成单链的DNADNA，并能，并能以有缺陷的噬菌体颗粒的形式被分泌出来。以有缺陷的噬菌体颗粒的形式被分泌出来。用作用作pEMBL8pEMBL8克隆实验的宿主大肠杆菌必须随克隆实验的宿主大肠杆菌必须随后被正常的后被正常的M13M13噬菌体感染。正常的噬菌体感染。正常的M13M13噬菌噬菌体是作为体是作为辅助噬菌
29、体辅助噬菌体(helper phage)，提供必，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。要的复制酶和蛋白质外壳。pEMBL8pEMBL8由于是从由于是从pUC8pUC8发展来的，同样也有插入发展来的，同样也有插入多接头的多接头的lacZlacZ基因，重组体可以通过在含基因，重组体可以通过在含有有X-galX-gal的培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。的培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。可以用可以用pEMBL8pEMBL8产生长度达到产生长度达到10kb10kb的单链的单链DNADNA片段，片段，这极大地扩展了这极大地扩展了M13M13克隆系统的使用范克隆系统的使用范围。3.3 基于基于噬菌体的克隆载体噬菌体的
30、克隆载体基于基于噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个难题：难题：(1)(1)噬菌体的噬菌体的DNADNA分子仅能再增加分子仅能再增加5 5，即，即新增新增加的加的DNADNA长度不能超过长度不能超过3kb3kb。一旦。一旦DNADNA的总长超的总长超过了过了52kb52kb，不能包装进入噬菌体的头部，也，不能包装进入噬菌体的头部，也就不能形成感染性的病毒颗粒。这严重制约就不能形成感染性的病毒颗粒。这严重制约了插入了插入DNADNA片段的长度，限制了片段的长度，限制了噬菌体载体噬菌体载体的使用。的使用。(2)(2)噬菌体基因组很大，对于几乎每一种限制噬菌体基因组很
31、大，对于几乎每一种限制性性内切酶识别位点都不是单一的内切酶识别位点都不是单一的。所以，无。所以，无法按我们的需要去酶切和按顺序重新装成有法按我们的需要去酶切和按顺序重新装成有功能的基因组。功能的基因组。3.3.1 3.3.1 从从噬菌体基因组移除部分片段噬菌体基因组移除部分片段而不损伤其生存能力而不损伤其生存能力发现：一个大的发现：一个大的DNADNA片段可以删除。片段可以删除。该片段位于该片段位于DNADNA的中部，删除后并不影响噬菌的中部，删除后并不影响噬菌体侵染大肠杆菌的能力。体侵染大肠杆菌的能力。去掉这个非必需片段，可以减小去掉这个非必需片段，可以减小15kb15kb。即，可。即，可以
32、在噬菌体包装前加入以在噬菌体包装前加入18kb18kb的外源的外源DNADNA。这一段非必需片段实际上包含一些基因，它们这一段非必需片段实际上包含一些基因，它们和和噬菌体整合与脱离大肠杆菌染色体相关。噬菌体整合与脱离大肠杆菌染色体相关。删除掉这一部分，删除掉这一部分，噬菌体成为一个非溶源性噬菌体成为一个非溶源性的噬菌体，进行裂解循环。这样无需诱导就的噬菌体，进行裂解循环。这样无需诱导就可以形成噬菌斑，这对于一个克隆载体来说可以形成噬菌斑，这对于一个克隆载体来说本身就是一个理想的特点。本身就是一个理想的特点。3.3.2 用自然选择来筛选那些缺少酶切位用自然选择来筛选那些缺少酶切位点的点的噬菌体噬
33、菌体即使从即使从噬菌体基因组中移掉那个大片段，对噬菌体基因组中移掉那个大片段，对于大多数内切酶来说还是有太多的识别位点。于大多数内切酶来说还是有太多的识别位点。如果仅仅要移除一两个这样的识别位点，我们如果仅仅要移除一两个这样的识别位点，我们可以通过体外突变来解决。可以通过体外突变来解决。例如，想要去掉一个例如，想要去掉一个EcoEcoRIRI的位点的位点GAATTCGAATTC，可以，可以把它突变成把它突变成GGATTCGGATTC，不会被，不会被EcoEcoRIRI切开。切开。但是，即使现在，要想改变一个但是，即使现在，要想改变一个DNADNA分子上的好分子上的好几个位点，体外突变仍不是一个
34、有效方法。几个位点，体外突变仍不是一个有效方法。实际上，可以用自然选择来选出那些缺少不需实际上，可以用自然选择来选出那些缺少不需要的酶切位点的要的酶切位点的噬菌体。噬菌体。选用可以产生选用可以产生EcoEcoRIRI的大肠杆菌做寄主，这样大的大肠杆菌做寄主，这样大多数的噬菌体多数的噬菌体DNADNA就被酶解掉了，但有少量的就被酶解掉了，但有少量的幸存者并产生了噬菌斑。幸存者并产生了噬菌斑。这些突变这些突变噬菌体缺少一个或者好几个噬菌体缺少一个或者好几个EcoEcoRIRI识识别位点。别位点。几个这样的感染循环过后，得到的几个这样的感染循环过后，得到的噬菌体是噬菌体是缺失全部或大多数缺失全部或大
35、多数EcoEcoRIRI位点的突变体。位点的突变体。3.3.3 3.3.3 插入载体和置换载体插入载体和置换载体解决包装限制和多酶切位点的问题后，就可以解决包装限制和多酶切位点的问题后，就可以着手开发各种基于着手开发各种基于噬菌体的克隆载体。噬菌体的克隆载体。最先产生的两类载体最先产生的两类载体:插入载体插入载体(insertion)置换载体置换载体(替换载体替换载体)(replacement)插入载体插入载体插入载体的构建过程：插入载体的构建过程：去掉一大段非必需片段，剩下的两段再连接去掉一大段非必需片段，剩下的两段再连接起来。起来。为了顺利地插入新的为了顺利地插入新的DNADNA，一个插入
36、载体必须，一个插入载体必须至少包含一个单酶切位点。至少包含一个单酶切位点。插入的插入的DNADNA片段的长度依赖于删除掉的非必需片段的长度依赖于删除掉的非必需片段的长度。片段的长度。两个常用的插入载体：两个常用的插入载体：(1)(1)gtl0gtl0 可以插入超过可以插入超过8kb8kb的外源的外源DNADNA。外源。外源DNADNA通过通过EcoEcoRIRI单酶切位点插入单酶切位点插入c cI I基因，并使该基因失基因，并使该基因失活，使得重组体的噬菌斑是清澈的而不是混活，使得重组体的噬菌斑是清澈的而不是混浊的。浊的。(2)(2)ZAPZAP 可以插入超过可以插入超过10kb10kb的外源
37、的外源DNADNA。携带的。携带的lacZlacZ基因上有一个多接头，外源基因插入基因上有一个多接头，外源基因插入到这个多接头上到这个多接头上6 6个酶切位点中的任何一个，个酶切位点中的任何一个，都会使该基因失活，从而使重组体的噬菌斑都会使该基因失活，从而使重组体的噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。是无色清澈的而不是蓝色的。置换载体置换载体一个一个置换载体有克隆所需限制性内切酶识别置换载体有克隆所需限制性内切酶识别的两个位点，而在这两个位点之间的的两个位点，而在这两个位点之间的DNADNA片段片段将会被外源的将会被外源的DNADNA所置换。所置换。通常被置换的那段通常被置换的那段DNADNA（克
38、隆术语中称为填充片（克隆术语中称为填充片段）含有其他的一些限制性酶切位点，可被段）含有其他的一些限制性酶切位点，可被切成许多小片段，因此在克隆实验中它重新切成许多小片段，因此在克隆实验中它重新被插入的可能性相当小。被插入的可能性相当小。置换载体可携带的置换载体可携带的DNADNA片段长度通常超过插入载片段长度通常超过插入载体。体。重组体的筛选往往基于它的大小：没有重组的重组体的筛选往往基于它的大小：没有重组的载体因为太小而不能被包装进入载体因为太小而不能被包装进入噬菌体的噬菌体的头部。头部。两个常用的置换载体：(1)(1)EMBL4EMBL4 可以携带超过可以携带超过20kb20kb的外源的外
39、源DNADNA。在填充片段的两边有成对的在填充片段的两边有成对的EcoEcoRIRI，BamBamHIHI和和SalSalI I的酶切位点。的酶切位点。用这用这3 3种酶中的任意一种进行酶切都可以除去种酶中的任意一种进行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的DNADNA。重组体的筛选可以基于它的大小，也可以应重组体的筛选可以基于它的大小，也可以应用用SpiSpi表型。表型。(2)(2)GEM11GEM11和和GEMl2GEMl2 都可以携带都可以携带23kb23kb的外源的外源DNADNA（接近理论上的最（接近理论上的最大值）。大值）。在填充
40、片段的两边各有一个多接头，含有在填充片段的两边各有一个多接头，含有7 7个个不同的限制性酶切位点。不同的限制性酶切位点。这两个载体多接头略有不同，但这两个载体多接头略有不同，但最外面的一最外面的一个都是个都是SfiSfiI I酶切位点酶切位点(GGCCNNNNNGGCC)(GGCCNNNNNGGCC)。这个这个序列极其罕见，不太可能出现在被克隆的序列极其罕见，不太可能出现在被克隆的DNADNA片段中。片段中。因此可以用因此可以用SfiSfiI I把克隆后的把克隆后的DNADNA片段完整地切片段完整地切下来。下来。和和EMBL4EMBL4相似，可以根据大小和相似，可以根据大小和SpiSpi表型筛
41、表型筛选重组体。选重组体。3.3.4 3.3.4 用用插入载体或置换载体插入载体或置换载体进行克隆实验进行克隆实验用用噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似：噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似：限制性酶酶切载体，加入新的限制性酶酶切载体，加入新的DNADNA，连接混合，连接混合物，产物分子转染大肠杆菌。物，产物分子转染大肠杆菌。这种实验需要把载体通过这种实验需要把载体通过coscos位点由氢键连接，位点由氢键连接，以环状分子形式存在。以环状分子形式存在。这种转染的方法在大多数情况下令人满意，但这种转染的方法在大多数情况下令人满意，但效率不高。效率不高。如果增加一两步操作，可以获得更多的重组体如果增
42、加一两步操作，可以获得更多的重组体。首先，要使用首先，要使用噬菌体载体的线状分子。噬菌体载体的线状分子。当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了左当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了左右两个相互分离的片段。右两个相互分离的片段。连接被克隆的连接被克隆的DNADNA和载体的左右两个片段，连和载体的左右两个片段，连接的结果可能有好几种不同的排列，其中包接的结果可能有好几种不同的排列，其中包含一些由重复序列组成的连环体，重复的单含一些由重复序列组成的连环体，重复的单位是：位是：载体的左片段载体的左片段被克隆的被克隆的DNADNA载载体的右片段。体的右片段。如果被插入的如果被插入的DNADNA是正确的大小
43、，那么分隔这是正确的大小，那么分隔这些重复序列的些重复序列的coscos相隔正确的距离，能够用于相隔正确的距离，能够用于体外包装。产生重组后的噬菌体可以感染大体外包装。产生重组后的噬菌体可以感染大肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，可以肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，可以获得大量的重组分子。获得大量的重组分子。3.3.5 3.3.5 用黏端质粒对大的用黏端质粒对大的DNADNA片段进行克隆片段进行克隆基于基于噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式是噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式是黏端质粒。黏端质粒。黏端质粒是噬菌体黏端质粒是噬菌体DNADNA和大肠杆菌质粒两者的杂和大肠杆菌质粒两者的杂交体。交体。
44、设计的基础：设计的基础：把噬菌体把噬菌体DNADNA装进噬菌体头部的酶，仅仅只需装进噬菌体头部的酶，仅仅只需要被包装的分子拥有要被包装的分子拥有coscos位点就能够发挥作用。位点就能够发挥作用。在体外包装系统中除了在体外包装系统中除了基因组外，任何长基因组外，任何长度在度在37kb37kb和和52kb52kb之间的之间的DNADNA分子，只要两端含分子，只要两端含有有coscos位点，就能被包装进噬菌体头部。位点，就能被包装进噬菌体头部。黏端质粒基本上算是一个携带cos位点的质粒。因为它缺少所有的因为它缺少所有的噬菌体基因且不能产生噬噬菌体基因且不能产生噬菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如
45、氨菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如氨苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起点。苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起点。采用黏端质粒的克隆实验步骤如下采用黏端质粒的克隆实验步骤如下:从单酶切位点切开黏端质粒从单酶切位点切开黏端质粒;加入新的加入新的DNADNA片段片段(这些片段通常是不完全这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于黏酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于黏端质粒来说太小了端质粒来说太小了););进行连接反应，形成连环体。进行连接反应，形成连环体。如果插入的如果插入的DNADNA大小合适，体外包装系统从大小合适，体外包装系统从coscos位点切开连环体，把重组后的黏端
46、质粒包位点切开连环体，把重组后的黏端质粒包装进成熟的噬菌体颗粒。装进成熟的噬菌体颗粒。用这些用这些噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。菌落才能生长。所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性的黏端质粒太小，根本不可能被包装的线性的黏端质粒太小，根本不可能被包装进噬菌体头部。进噬菌体头部。3.4 3.4 载体和其他高容量的载体载体和其他高容量的载体使基因组文库得以建立使
47、基因组文库得以建立基于基于噬菌体的载体的主要用途是克隆那些不噬菌体的载体的主要用途是克隆那些不能被质粒或能被质粒或M13M13载体所操作的载体所操作的DNADNA大片段。大片段。插入的外源插入的外源DNADNA片段：片段：M13M13载体：不超过载体：不超过3kb3kb 质粒：不超过质粒：不超过8kb8kb 置换载体置换载体EMBL4EMBL4：达到：达到20kb20kb 某些黏端质粒：某些黏端质粒：40kb40kb。这种可以克隆如此之大的这种可以克隆如此之大的DNADNA片段的能力，使得片段的能力，使得人们可以建立基因组文库。人们可以建立基因组文库。基因组文库：基因组文库：一套覆盖某个生物体
48、所有一套覆盖某个生物体所有DNADNA的重组体克隆。的重组体克隆。例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因。的大肠杆菌基因。据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易在研究组织间相互传播。以很容易在研究组织间相互传播。当要建立基因组文库时，面临一个重要的当要建立基因组文库时，面临一个重要的问题：一个基因组文库到底需要多少个问题：一个基因组文库到底需要多少个克隆克隆?可以用下面的公式计算：可以用下面的公式计算：N=ln(1
49、-N=ln(1-P P)ln(1-aln(1-ab)b)N N指所需要的克隆的个数，指所需要的克隆的个数，P P是得到所有基是得到所有基因的可能性，因的可能性，a a是插入到载体中去的是插入到载体中去的DNADNA片段的平均大小，片段的平均大小，b b是基因组的大小。是基因组的大小。从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基因从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基因是不明智的。是不明智的。减少克隆数的方法：减少克隆数的方法：方法一：开发能够携带更大方法一：开发能够携带更大DNADNA片段的克隆载体。片段的克隆载体。细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACsBACs）：）：基于基于F F质粒构建的新载
50、体。质粒构建的新载体。F F质粒相对较大，由它开发的载体有着比普通质粒相对较大，由它开发的载体有着比普通质粒载体大很多的容量。质粒载体大很多的容量。BACBAC能够插入能够插入超过超过300kb300kb的的DNADNA片段，由此使人片段，由此使人类基因组文库的克隆数下降到类基因组文库的克隆数下降到30 00030 000个。个。基于噬菌体基于噬菌体P1P1发展而来的载体发展而来的载体 P1P1优于优于的地方：能够在它的蛋白质外壳中的地方：能够在它的蛋白质外壳中挤进挤进110kb110kb的的DNADNA。基于噬菌体基于噬菌体P1P1设计的黏端质粒可以用于克隆长设计的黏端质粒可以用于克隆长度从
