1、蛋白质分子中的结构层次蛋白质分子中的结构层次一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构亚基亚基 四级结构四级结构N N末端末端C C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构 蛋白质的根本差异在于一级结构的不同蛋白质的根本差异在于一级结构的不同多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析一级结构测定一级结构测定 多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（纯度分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（纯度97%97%以上）以上）测定多肽链的测定多肽链的氨基末端氨基末端与与羧基末端羧基末端为何种氨基酸残基为何
2、种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用EdmanEdman降解降解法法一般需用一般需用数种水解法数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过后经过组合排列对比组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序结果。，最终得出完整肽链中氨基酸顺序结果。胰蛋白酶：胰蛋白酶：水解水解赖氨酸赖氨酸和和精氨酸精氨酸的的羧基羧基形成的肽键；形成的肽键；糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：水解芳香水解芳香族氨基酸族氨基酸【苯丙氨酸（苯丙氨酸（PhePh
3、e）、酪氨酸）、酪氨酸（TyrTyr）、色氨酸（）、色氨酸（TrpTrp）】等氨基酸残等氨基酸残基的基的羧基羧基形成的肽键。形成的肽键。胃蛋白酶：专一性较差，主要水解胃蛋白酶：专一性较差，主要水解GluGlu、AspAsp或其他氨基酸的侧链。或其他氨基酸的侧链。则其氨基酸排列顺序为：则其氨基酸排列顺序为：ThrThr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如测一个九肽如测一个九肽测得测得N N端氨基酸残基为端氨基酸残基为ThrThr又分别测得片段又分别测得片段:Ala-Ala-TrpAla-Ala-Trp-Gly-Lys-
4、Gly-Lys Val-LysVal-Lys-Ala-Ala-TrpAla-Ala-TrpThrThr-Asn-Asn-Val-LysVal-Lys 当一种4肽与FDNB反应后,用5.7mol/L HCl水解得到DNP-Val及3种其他氨基酸;当这4肽用胰蛋白酶水解时发现有两种碎片段，其中一片用LiBH4还原后再进行酸水解,水解液内有氨基乙醇和一种在有浓硫酸条件下能与已醛酸反应产生紫(红)色产物的氨基酸.试问这4肽的一级结构是由哪几种氨基酸。（LiBH4还原羧酸成为醇类，可使C-末端AA还原为相应的氨基醇。）分析：FDNB即2，4-二硝基氟苯，在弱碱性溶液中可与肽链N-末端的氨基酸生成黄色的二
5、硝基苯氨基酸（DNP-AA）。盐酸水解可以打开所有的肽链，使蛋白质或者多肽变为游离的氨基酸。LiBH4还原羧酸成为醇类，可使C-末端AA还原为相应的氨基醇。胰蛋白酶可专一性水解由碱性氨基酸（lys，Arg）羧基端形成的肽键。解题：解题：（1 1）四肽与）四肽与FDNBFDNB反应后，用反应后，用5.7mol/LHCl5.7mol/LHCl水解得到水解得到DNP-DNP-ValVal，证明，证明N N端为端为ValVal；（2 2）LiBHLiBH4 4还原后再水解，水解液中有氨基乙醇，还原后再水解，水解液中有氨基乙醇，GlyGly是氨基乙酸，证明肽的是氨基乙酸，证明肽的C C端为端为GlyGl
6、y；（3 3）水解液中有在浓）水解液中有在浓H H2 2SOSO4 4条件下能与乙醛酸反应产生条件下能与乙醛酸反应产生紫红色产物的氨基酸，说明此氨基酸为紫红色产物的氨基酸，说明此氨基酸为TrpTrp；（4 4）根据胰蛋白酶的专一性，得知此肽键）根据胰蛋白酶的专一性，得知此肽键-COOH-COOH末端是末端是LysLys或者或者ArgArg；根据以上结果可知道四肽的顺序：根据以上结果可知道四肽的顺序：ValLysTrpGlyValLysTrpGly或者或者ValArgTrpGlyValArgTrpGly。蛋白质多肽链本身的折叠盘绕方式。蛋白质多肽链本身的折叠盘绕方式。氢键氢键、盐键、疏水键、范德
7、华力盐键、疏水键、范德华力肽肽 单单 元元RC C COORNCN它是蛋白质构象的它是蛋白质构象的基本结构单位基本结构单位1 1、-螺旋螺旋:从从N端为起点，多肽链主链围绕中心轴形成端为起点，多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋右手螺旋，侧链侧链伸向螺旋外侧。伸向螺旋外侧。氢键是稳定螺旋的主要键），螺旋的结构特点例题：一个螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？计算该-螺旋片段的轴长。解答：180/3.6=50圈，500.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。例题：一个含有78个氨基酸残基的螺旋的轴长是多少？此多肽的螺旋完全伸展时多长？解答：780.15=11.7
8、nm 螺旋每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，故该螺旋圈数为：783.6圈；螺旋的直径约为0.5nm，故每圈轴长为0.5nm。完全伸展的螺旋长度约为：0.5（783.6）34.01nm多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。结构，侧链位于锯齿结构的上下方。2 2、-折叠折叠两段以上的两段以上的-折折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行，反平叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行，反平行结构更为稳定行结构更为稳定 。两链间的肽键之间形成两链间的肽键之间形成氢键氢键，以稳固，以稳固-折叠结构。氢键折叠结构。氢键
9、与螺旋长轴与螺旋长轴垂直垂直。反平行反平行平行平行3 3、-转角转角蛋白质多肽链经常出现蛋白质多肽链经常出现180180的回折，这种肽的回折，这种肽链回折处的称为链回折处的称为-转角（转角（-tern-tern）或）或-bend-bend，或，或称发夹结构（称发夹结构（hairpin structurehairpin structure）。一般由四个连续的氨基酸残基一般由四个连续的氨基酸残基组成组成，第一个氨基酸残基与第四个形成第一个氨基酸残基与第四个形成氢氢键键。4 4、环环环多存环多存在于球状蛋白质分子中，形在于球状蛋白质分子中，形状像状像“”，称为，称为环（环（looploop）。由由6
10、-166-16个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成5 5、无规卷曲（自由回转）、无规卷曲（自由回转）是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。酶的功能部位常位于这种构象区域酶的功能部位常位于这种构象区域H H2 2N NCOOHCOOH氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链的氨基酸残基的侧链适合形成一段肽链的氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋螺旋或或-折叠时，它就会出现相应的二级结构。折叠时，它就会出现相应的二级结构。1 1、超二级结构、超二级结构
11、（Supersecondary structure）在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构几种类型的超二级结构：（三）（三）二、三级过渡态二、三级过渡态 蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构域2 2、结构域、结构域 多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成叠成的的近似球状近似球状、具有部分具有部分生物功能生物功能的结构，的结构，纤连蛋白分子的
12、结构域纤连蛋白分子的结构域 丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶（一）（一）定义：定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。由一个或多个结构域组装而成的结构。位置。由一个或多个结构域组装而成的结构。肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是氢键和离子键氢键和离子键。蛋白质分子中各亚基的空间排布、亚基间蛋白质分子中各亚基的空间排布、亚基间通过非共价键聚合而成的特定构象，称为通过非共价键聚合而成的特定构象，称为蛋白蛋白质的四级结构。质的四级结构。由多条
13、多肽链组成的蛋白质，肽链间相互由多条多肽链组成的蛋白质，肽链间相互以以非共价键非共价键联结成一个联结成一个活性单位活性单位，这种肽链就，这种肽链就称为该称为该蛋白质的亚基蛋白质的亚基。血红蛋白（血红蛋白（Hb）的四级结构）的四级结构维系蛋维系蛋白质分子的一级结构的键：肽键、二硫键白质分子的一级结构的键：肽键、二硫键维系蛋白质分子空间结构：维系蛋白质分子空间结构：疏水键疏水键 氢键氢键 范德华力范德华力 盐键（离子键）盐键（离子键）蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节（一）一
14、级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 这种由这种由蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序发发生变异所导致的疾病，称为生变异所导致的疾病，称为“分子病分子病”。正常红细胞正常红细胞镰刀形细胞镰刀形细胞（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能
15、的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 目目 录录（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 HbHb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合，Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百的百分数（称分数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变浓度变化而改变。肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线*协同效应协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个
16、亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)O2血红素与氧结血红素与氧结合后，合后，铁原子半径铁原子半径变小变小，就能进入卟，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。变（别）构效应变（别）构效应(allosteric effect)某些蛋白质表现其生物学功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别
17、构效应。(R)relaxed state(T)tense state 血液中血液中O2的的运输运输 (Hb R/T(Hb R/T态的互换态的互换)Lung氧分子Hemoglobin血红蛋白血红蛋白Myoglobin肌红蛋白肌红蛋白Muscle静脉静脉动脉动脉环境氧浓度高时环境氧浓度高时Hb 快速吸收氧分子快速吸收氧分子环境氧浓度低时环境氧浓度低时Hb 迅速释放氧气迅速释放氧气任何一个亚基接受任何一个亚基接受O O2 2后，会增加其他亚基吸收后，会增加其他亚基吸收O O2 2的能力的能力释放氧气后释放氧气后Hb 变回变回 T state（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质
18、构象疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓
19、变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第四节第四节蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化The Physic
20、al and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein 蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 蛋白质的变性蛋白质的变性 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质1 1、蛋白质的两性解离和电泳现象、蛋白质的两性解离和电泳现象 蛋白质分子蛋白质分子与多肽、氨基酸一样，与多肽、氨基酸一样，除两端的除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链侧链中某中某些基团，在一定的溶液些基
21、团，在一定的溶液pHpH条件下都可解离成条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。带负电荷或正电荷的基团。PrNH3+COOHPrNH3+COO-PrNH2COO-OH-H+OH-H+兼性离子pH=pI阳离子pHpI蛋白质的两性解离性质使其成为人体及动物体中的蛋白质的两性解离性质使其成为人体及动物体中的重要缓冲剂，调节体液正常重要缓冲剂，调节体液正常pH。蛋白质蛋白质蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电
22、净电荷为零荷为零，此时溶液的，此时溶液的pHpH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质较稳定，其在等电点时，蛋白质较稳定，其溶解度、导溶解度、导电性、黏度、渗透压等皆最小（制备或沉淀蛋白电性、黏度、渗透压等皆最小（制备或沉淀蛋白质）质），在电场中不移动（分离蛋白质）在电场中不移动（分离蛋白质）。在不同的在不同的pH环境下，蛋白质的电化学环境下，蛋白质的电化学性质不同。性质不同。在等电点在等电点偏酸性偏酸性溶液中，蛋白质粒子带溶液中，蛋白质粒子带负负电荷电荷，在电场中向正极移动；，在电场中向正极移动；在等电点在等电点偏碱性偏碱性溶液中，蛋白质粒子带溶液中，蛋白质粒子带正正电荷电
23、荷，在电场中向负极移动。，在电场中向负极移动。利用蛋白质两性电离的性质，可通过利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。电泳电泳 蛋白质在等电蛋白质在等电点点pHpH条件下，条件下，不发生电泳现不发生电泳现象。象。利用蛋白质的利用蛋白质的电泳现象，可电泳现象，可以将蛋白质进以将蛋白质进行分离纯化。行分离纯化。例 题 根据蛋白质等电点，指出下列蛋白质在所指根据蛋白质等电点，指出下列蛋白质在所指定的定的pHpH条件下，电泳时的泳动方向：条件下，电泳时的泳动方向：(1)(1)胃蛋白酶胃蛋白酶(pI(pI 1.0)1.0)
24、，在，在pHpH 5.05.0；带负电，向正极泳动带负电，向正极泳动 (2)(2)血清清蛋白血清清蛋白(pI(pI 4.9)4.9)，在，在pHpH 6.06.0；带负电，向正极泳动带负电，向正极泳动 (3)-(3)-脂蛋白脂蛋白(pI(pI 5.8)5.8)，在，在pHpH 5.05.0和和pHpH 9.09.0；在在pHpH 5.05.0时带正电，向负极泳动；在时带正电，向负极泳动；在pHpH 9.09.0带负电，向正极泳动带负电，向正极泳动 2 2 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物蛋白质属于生物大大分子，分子量可自分子，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万
25、之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。因此为胶粒范围之内。因此，它在水中能够形成，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉 蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性
26、质，如丁达尔现象、布郎运动等。达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用因此可以应用透析法透析法将非蛋白的小分子杂质将非蛋白的小分子杂质除去。除去。3 3 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大它的分子量大小、所带的电荷和水化作用小、所带的电荷和水化作用有关。有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。中沉淀出来。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 根据蛋白
27、质的亲水胶体性质，当其环境发根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变生改变（加入适当的试剂使蛋白质分子处（加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层）于等电点状态或失去水化层）时，蛋白质时，蛋白质的胶体溶液就不再稳定并将发生沉淀作用的胶体溶液就不再稳定并将发生沉淀作用(Precipitation)。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。3 3 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用（1 1）可逆沉淀：）可逆沉淀：在在温和温和条件下，通过改变溶液的条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质发
28、生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。使蛋白质重新溶于原来的溶液中。在沉淀过程中，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化结构和性质都没有发生变化，在适，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为淀又称为非变性沉淀非变性沉淀。因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质
29、的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如如等电点沉淀法等电点沉淀法、盐析法盐析法和和有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等。等。3 3 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用（2 2）不可逆沉淀：）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，在强烈沉淀条件下，蛋白蛋白质发生沉淀后质发生沉淀后不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质破坏了蛋白质的结构和性质，产，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，不能用透析等方法除去不能用透析等方法除去沉淀剂后使蛋白质重新溶于原来的溶液中。沉淀剂后使蛋白质重新溶于原来的溶液中。
30、由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为化，所以又称为变性沉淀变性沉淀。如如加热沉淀加热沉淀、强酸碱沉淀强酸碱沉淀、重金属盐沉淀重金属盐沉淀和和生生物碱沉淀物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。等都属于不可逆沉淀。使蛋白质沉淀的试剂：使蛋白质沉淀的试剂：1.1.高浓度中性盐：高浓度中性盐：（NHNH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl 这种加入盐中和蛋白质的电荷，使蛋白质沉淀析出的现这种加入盐中和蛋白质的电荷，使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。象称为盐析，用于蛋白质分离制备。2.2.有机溶剂有
31、机溶剂 ：丙酮、乙醇：丙酮、乙醇 破坏蛋白质水膜破坏蛋白质水膜3.3.重金属盐：重金属盐：HgHg2+2+、AgAg+、PbPb+与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐4.4.生物碱试剂：生物碱试剂：苦味酸、三氯乙酸、目酸、钨酸等苦味酸、三氯乙酸、目酸、钨酸等 与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturationdenaturation)：在某些物：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间
32、构象空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，引起其理化性质改变并导致其结构，引起其理化性质改变并导致其生物活性生物活性丧失的丧失的现象。现象。4 4、蛋白质的变性、蛋白质的变性 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构。变性蛋白质通常都是变性蛋白质通常都是固体状态固体状态物质，不溶于物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀不可逆沉
33、淀。应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。豆腐的制作豆腐的制作急救急救 ：中毒后灌豆浆、牛奶等：中毒后灌豆浆、牛奶等煮熟食物方便消化煮熟食物方便消化防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation)。天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巯巯基
34、乙基乙醇醇去除去除尿素、尿素、-巯巯基乙基乙醇醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 大部分蛋白质均含有大部分蛋白质均含有带芳带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280280nm nm 附近有最大吸收。因此，附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在大多数蛋白质在280280nm nm 附附近显示强的吸收。近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋利用这个性质，可以对蛋白质进行白质进行定性定性鉴定。鉴定。5 5 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收6 6、蛋白质的颜色反应、蛋白质的颜色反应 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先研究蛋白质的结构、性质
35、和功能，首先需要得到需要得到纯的蛋白质样品纯的蛋白质样品。(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；和植物细胞；(2)(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量量。(3)(3)分离和纯化过程都必须在分离和纯化过程都必须在温和温和的条件的条件下进行。下进行。二、蛋白质分离和纯化二、蛋白质分离和纯化(1)(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超研磨法、超声波法、冻融法和酶解法声波法、冻融法和酶解法等。等。(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。根据蛋白质的特性，选择不同
36、的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提酸性蛋白用稀碱性溶液抽提 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)(3)粗提粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。1 1蛋白质的分离步骤蛋白质的分离步骤 沉淀法沉淀法 膜分离法膜分离法
37、 萃取法萃取法 层析法层析法 电泳法电泳法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法*盐析：盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和蛋白质表面电荷被中和以及以及水化膜被破坏水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。，导致蛋白质沉淀。阴离子化合物的效果是：阴离子化合物的效果是：NHNH4 4+KK+NaNa+阳离子化合物的效果是：阳离子化合物的效果是：POPO4 43-3-SOSO4 42-2-ClCl-常用的盐为常用的盐为硫酸铵硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，同，盐析时所需的盐的浓
38、度也不相同，因而盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分可以将不同的蛋白质加以分离。离。(1)沉淀法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 在蛋白质溶液中，加入一定量的在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的与水互溶的有机溶剂有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够能够破坏蛋白质的水化层破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。度降低而沉淀。常用的有机溶剂有常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮等。为等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂溶剂浓度不能太高浓度不能太高(3
39、0%-50%)(30%-50%)，而且需要在，而且需要在低低温温条件下进行。条件下进行。(1)沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法(1)沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质分子在蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集，因而容易聚集形成沉淀。形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的当蛋白质混合物溶液的pH pH 被调到某一成分被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该淀出来。而那些等电点高于或低于该pH pH 的的
40、蛋白质仍然留在溶液中。蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点该法适用于在等电点pHpH稳定的蛋白质稳定的蛋白质2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 透析法透析法 DialysisDialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。截止分子量一般为一万。2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法2 2蛋
41、白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 透析透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为通透动力为半透膜两侧的物质浓度差半透膜两侧的物质浓度差。透析法透析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 超过滤技术是在一定的密封容器，施加超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定一定压力压力使一定分子量的物质透过超滤使一定分子量的物质透过超滤膜。膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。
42、超滤器板式超滤器。超滤膜的截止分子量有超滤膜的截止分子量有100100万、万、5050万、万、3030万、万、1010万、万、5 5万、万、1 1万、万、5 5千和千和1 1千（道尔千（道尔顿，顿，DrDr）2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 两种亲水性高分子或一种高分子聚合两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因物与一种盐溶液混合后，因疏水性差疏水性差异异而分层。而分层。不同的蛋白质不同的蛋白质在疏水层的在疏水层的溶解能力不同溶解能力不同而被萃取而被萃取。目前主要采用两种体系目前主要采用两种体系 聚乙二醇聚乙二醇-葡聚糖葡聚糖 聚乙二
43、醇聚乙二醇-磷酸钾磷酸钾双水相萃取法双水相萃取法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 由于由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。些蛋白质。将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。反相胶束内。（3）萃取法反相胶束萃取法反相胶束萃取法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 最常用的是最常用的是二氧化碳二氧化碳，在，在78.3
44、78.3M Mpapa压力下压力下，COCO2 2处于液体状态，温度为处于液体状态，温度为31.131.1C C，当当压力或温度发生改变时，压力或温度发生改变时，COCO2 2处于气液中处于气液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。升温等步骤即可分离出来。2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 此法是利用此法是利用离子交换树脂离子交换树脂作为柱层析支持物，作为柱层析支持物，将将带有不同电荷带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。的
45、蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。氨基乙基纤维素等）。带带正电荷多正电荷多的蛋白质与树脂的蛋白质与树脂结合较强结合较强，而带正，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓用不同浓度的阳离子洗脱液，如度的阳离子洗脱液，如NaClNaCl溶液进行梯度洗脱溶液进行梯度洗脱，通过，通过NaNa+的离子交换作用，可以将带有不同正的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。电荷的蛋白质进行分离。
46、离子交换层析法离子交换层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法4）层析法离子交换层析法离子交换层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 此法又称为此法又称为分子筛层析、分子排阻层析分子筛层析、分子排阻层析。凝。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部内部是多孔的网状结构是多孔的网状结构。Sephadex-Sephadex-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200 Sepharose-Sepharose-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2 2B,4B,6BB,4B,6B Seph
47、acryl-Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S400（4）层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法（4）层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 利用利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2 2mol/Lmol/L或或3 3mol/LNaClmol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通溶解样品，洗脱时可
48、通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。脱。正丁基正丁基-SepharoseSepharose、正辛基正辛基-SepharoseSepharose 苯基苯基-SepharoseSepharose（4）层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用
49、化学方法将该配基与载用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。的配体洗脱液洗脱。（4）层析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 常用的配基常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋有抗
50、体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体层析柱载体为琼脂糖凝胶等。为琼脂糖凝胶等。（4）层析法2 2蛋白质的纯化方蛋白质的纯化方法法 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为性相反的电极移动，这种现象称为电泳电泳。蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动，从而达到分离各种蛋白质。在外加电场作用下，在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（场中移动的速度（v v）取决于取决于电场强度电场强度(E)E)，所带的净电荷所带的净电荷(
