1、第一章第一章 血液标本采集与处理血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第三章第三章 抗体制备抗体制备王王 辉辉目 录第一节 免疫原的制备第二节 免疫佐剂第三节 多克隆抗体的制备及应用第四节 单克隆抗体的制备及应用第五节 基因工程抗体及应用 抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性免疫应答的重要产物，也是免疫学实验中的常用试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学实验室诊断中广泛应用。第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备免疫原（免疫原（immunogenimmunogen）是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。在抗体制备过程中，多种因素能够影响所制备抗体的质量，但高质
2、量的免疫原是制备合格抗体的前提条件。一、颗粒性抗原一、颗粒性抗原颗粒性抗原主要包括人和各种动物细胞抗原、细菌抗原和寄生虫抗原等。常用的抗原为:绵羊红细胞、细菌抗原和细胞膜抗原。二、可溶性抗原二、可溶性抗原蛋白质（糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体和细菌外毒素）、多糖和核酸等都是可溶性抗原。（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提组织细胞抗原的制备组织细胞抗原的制备：粉碎的方法有两种：高速组织捣碎机法和研磨法。细胞可溶性抗原的制备细胞可溶性抗原的制备：常用的细胞破碎方法有超声破碎法、酶处理法、冻融法和表面活性剂处理法。（二）可溶性抗原的纯化（二）可溶性抗原的纯化一般采用的纯化方法
3、有超速离心法、选择性沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。（三）免疫球蛋白片段的制备（三）免疫球蛋白片段的制备免疫球蛋白片段的制备方法有解离二硫键、溴化氰裂解法和酶裂解法。三、半抗原三、半抗原半抗原（半抗原（haptenhapten）是指只有抗原性而无免疫原性的物质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他化学物质等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把半抗原与蛋白质等大分子物质结合后，才能剌激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。半抗原-载体的连接方法：带有游离羧基或游离氨基以及两种基团均有的半抗原带有羟基、醛基和酮基的半抗原芳香族半抗原第二节第二节 免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂(im
4、munoadjuvant)(immunoadjuvant)是指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。一、佐剂的种类一、佐剂的种类主要包括：生物性佐剂、无机化合物佐剂、人工合成佐剂。弗氏佐剂（Freund adjuvant,FA）可分为:弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂。佐剂与抗原混合乳化的方法佐剂与抗原混合乳化的方法有两种：研磨法、搅拌混合法。二、佐剂的生物学作用二、佐剂的生物学作用1.增强抗原免疫原性，使无或弱免疫原性的物质成为持久或强免疫原。2.增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次免疫应答产生抗体的效价。3.促进抗体类型转换，
5、使产生的抗体由IgM转变为IgG。4.引起或增强迟发型超敏反应。三、佐剂的作用机制三、佐剂的作用机制1.改变抗原物理性状，延缓抗原降解，延长抗原在体内的停留时间，从而有助于抗原提呈细胞(APC)对抗原的摄取。2.诱导产生炎症反应，吸引APC到达炎症感染部位并使之活化,增强APC对抗原的加工和提呈。3.刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。第三节第三节 多克隆抗体的制备及应用多克隆抗体的制备及应用一、免疫动物的选择一、免疫动物的选择抗原与动物种属之间的关系动物的个体因素抗原的性质与动物种类抗体的用量和要求IgY有如下几方面的优点有如下几方面的优点 无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提
6、取抗体；使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY；IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在，因此容易保存和运输；由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉反应；IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。二、抗原剂量的选择二、抗原剂量的选择抗原的注射剂量应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。三、免疫程序三、免疫程序动物产生抗体的过程符合抗体产生的一般规律即初次免疫应答和再次免疫应答的规律。一般在首次接触抗原7天10天后
7、，动物血清中才有抗体出现，并在14天21天内达到高峰，随后开始下降。通常首次免疫后3周左右进行加强免疫，加强免疫至少2次，必要时需3次5次。四、采血方法四、采血方法颈动脉放血法静脉采血法心脏采血法五、抗血清鉴定及保存五、抗血清鉴定及保存抗体效价和纯度的测定抗体特异性的鉴定抗体亲和力的鉴定抗血清的保存六、抗体的纯化六、抗体的纯化IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化：盐析法粗提-球蛋白、离子交换层析提取IgG、亲和层析法。特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法七、多克隆抗体的特性和应用七、多克隆抗体的特性和应用 用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的新生儿溶血症等。用于某些感
8、染性疾病和移植排斥反应等的治疗。应用于某些疾病的临床检验。在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。第四节第四节 单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体（McAb）的特点是理化性状高度均一、纯度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验标准化和大量制备。一、杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有两种亲代细胞的特性，既保留了骨髓瘤细胞在体外培养无限增殖的特点，又继承了致敏B细胞可合成和分泌特异性抗体的能力。杂交瘤技术使用的选择培养基是在
9、普通细胞培养液中加入次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字头称为HAT培养基。二、杂交瘤细胞的制备过程二、杂交瘤细胞的制备过程亲本细胞的选择和融合选择培养基的应用抗原特异性杂交瘤细胞的筛选三、单克隆抗体的生产三、单克隆抗体的生产大量制备单克隆抗体的方法主要有两种，一种是动物体内诱生法，另一种是体外细胞培养法。动物体内诱生法动物体内诱生法 是目前McAb大量制备的主要方法。体外细胞培养法体外细胞培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。兔单克隆抗体兔单克隆抗体兔单克隆抗体兔单克隆抗体兔McAb在EL
10、ISA试验和免疫组化（IHC）中拥有更高的亲和力和特异性。兔McAb能够以识别许多在小鼠中不产生免疫应答的抗原。由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。与鼠McAb的人源化相比，兔McAb的人源化更容易。四、单克隆抗体纯化四、单克隆抗体纯化预处理常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法。纯化方法：一般采用盐析、凝胶过滤、辛酸提取和离子交换层析等方法进行纯化。最有效的McAb纯化法为亲和层析法。常用SPA或抗小鼠Ig抗体与琼脂糖交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，可获得高纯度的单抗。五、单克隆抗体鉴定五、单克隆抗体鉴定抗体效价测定抗体特异性鉴定Ig类型鉴定六、单克
11、隆抗体的特性六、单克隆抗体的特性高度特异性高度均一性弱凝集反应和不呈现沉淀反应细胞毒作用较弱对环境敏感性七、单克隆抗体的应用七、单克隆抗体的应用临床检验诊断试剂蛋白质的纯化肿瘤的导向治疗放射免疫显像技术第五节第五节 基因工程抗体及应用基因工程抗体及应用基因工程抗体（基因工程抗体（genetic engineering antibodygenetic engineering antibody）又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。一、人源化抗体一、人源化抗体人源化抗体人源化抗体(humanized
12、antibody)(humanized antibody)是指利用基因克隆及DNA重组技术对产生鼠源McAb的杂交瘤细胞内抗体基因进行改造，使其分泌的McAb中大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既保留了亲本鼠McAb的特异性和亲和力，又降低了其异源性，以利于临床应用。人人-鼠嵌合抗体（鼠嵌合抗体（human-mouse chimeric antibodyhuman-mouse chimeric antibody）是利用DNA重组技术，从杂交瘤细胞中分离出鼠源McAb功能性IgV区基因，与人IgG C区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，构建人-鼠嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿
13、主细胞中表达的抗体。为进一步降低抗体的免疫原性，人们应用基因工程技术将鼠源McAb中互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，即为CDR植入抗体。二、小分子抗体二、小分子抗体小分子抗体小分子抗体是指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。优点优点表现为:分子量小、可在大肠杆菌等原核细胞中表达、免疫原性要比原来的McAb弱得多、不含Fc段有利于作为靶向药物的载体、半衰期短、周转快有利于放射免疫成像检查肿瘤。1.1.抗原抗原结合片段结合片段(Fab)(Fab)由一条完整的L链和约1/2的H链组成，具有与完整抗
14、体相同的抗原结合特性，但只能结合一个抗原表位。2.2.可变区可变区片段片段(Fv)(Fv)和单链抗体和单链抗体(ScFv)(ScFv)Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能性片段，是由VL链和VH链以非共价键结合而成的单价小分子，为完整抗体的1/6。3.3.重链重链抗体（抗体（heavy chain antibody,HcAbheavy chain antibody,HcAb）是指缺失L链的H链同型二聚体。通过基因工程可以获得保留抗原结合活性的重链抗体可变区，也称为单域重链抗体（单域重链抗体（single domain single domain heavy chain antibody,
15、sdHcAbheavy chain antibody,sdHcAb）。重链抗体以其分子量小，稳定性高，免疫原性弱，组织穿透力强，可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位等特点，显示出其与常规抗体相比在抗体-抗原结合及免疫防御中的优势。三、双特异性抗体三、双特异性抗体双特异性抗体双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)(bispecific antibody,BsAb)是指同时能与两种不同特异性的抗原发生结合的抗体。它不同于天然抗体，其两抗原结合部位具有不同的特异性。（一）双特异抗体分子的构建（一）双特异抗体分子的构建1.1.双双特异抗体分子片段的体外构建特异抗体分子片段的
16、体外构建 利用一个二聚化结构域将两个ScFv组装成一个异二聚体分子，例如亮氨酸拉链(leucine zipper)为二聚化结构域可连接两个小分子抗体。2.2.双双特异抗体分子片段的细胞内组建特异抗体分子片段的细胞内组建 通过对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双特异抗体分子，较体外组建更为简便有效。（二）双特异性抗体的应用（二）双特异性抗体的应用在免疫检测中的应用在肿瘤放射免疫显像中的应用双特异性抗体介导的药物杀伤效应双特异性抗体介导的细胞杀伤效应四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白抗体融合蛋白抗体融合蛋白(antiteody fusion protein)(antiteody fusion
17、 protein)是指利用基因工程方法重组表达的抗体片段与其他生物活性蛋白融合的产物。含含FabFab段或段或FvFv的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白 将Fv与某些毒素、细胞因子及酶等的基因拼接，通过Fv的引导可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，更有效地在局部发挥生物学功能而降低毒副作用。含含FcFc的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白 将某些功能性蛋白分子与抗体Fc段融合可产生两种效果:延长该蛋白在体内的半衰期；通过功能性蛋白与其配体的作用，将抗体Fc段的生物学效应引导至特定的目标。五、噬菌体抗体库技术五、噬菌体抗体库技术抗体库技术（抗体库技术（antibody libraryantibody lib
18、rary）是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异性抗体基因的克隆，从而获得特异性的抗体。抗体库技术抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破PCR技术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因；利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片段。噬菌体抗体库（噬菌体抗体库（phage antibody libraryphage antibody library）技术）技术就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳表面。噬菌体抗体
19、库分为3种：天然抗体库(naive library)免疫抗体库(immune library)合成抗体库(synthetic library)噬菌体抗体库主要工作流程 从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因或可变区基因，获得全部的Ig的cDNA文库。利用噬菌体展示技术，使Ig在噬菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。筛选含有目的Ig表达的噬菌体。建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。扩增制备噬菌体抗体。纯化抗体。噬菌体抗体库技术的主要特点方法简单易行筛选容量增大直接得到抗体的基因可模仿体内免疫过程可以获得一些用传统方法难于制备的抗体六、重组多克隆抗体六、重组多克隆抗体重组PcAb模拟
20、了天然PcAb的产生过程，能够克服抗血清和McAb的缺点将成为治疗复杂疾病，如感染性疾病、肿瘤和自身免疫病安全有效的制剂。制备流程制备流程从抗体库中筛选有功能的抗体基因，克隆到定点整合系统的载体上，与重组酶表达载体一起共转染相应的宿主细胞，筛选稳定表达抗体基因的细胞克隆，分别冻存。根据需要混合若干克隆建成主细胞库和工作细胞库，它们是由若干表达不同抗体的来自同一母本细胞的细胞系混合而成。七、基因工程抗体的应用七、基因工程抗体的应用用于肿瘤的治疗肿瘤的影像分析 抗感染作用细胞内抗体用于临床诊断重点提示重点掌握免疫血清的制备、杂交瘤技术的原理及基因工程抗体的应用。本章小结抗体制备的第一步是制备并纯化免疫原。制备多克隆抗体选择动物时要考虑的因素。常用的动物采血法有三种。McAb制备过程是将致敏B细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤。基因工程抗体包括应用DNA重组和蛋白工程技术对已有的McAb进行改造。
