1、.1.2人类人类基因组基因组计划计划基因基因测序测序基因组基因组概述概述.3基因组概述基因组概述DNA基因基因基因组基因组.4DNA双螺旋的发现双螺旋的发现里程碑里程碑1953年，沃森和克里克提出了DNA 双螺旋结构,标志着生物科学的发展进入了分子生物学阶段，使遗传的研究深入到分子层次,“生命之谜”被打开,人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。.5基因基因控制生物性状的基本遗传单位。控制生物性状的基本遗传单位。基因（基因（gene）：）：带有遗传讯息的DNA片段称为基因。结构基因外显子（编码序列)内含子（非编码序列)非结构基因顺式作用元件启动子上游启动子元件反应元件增强子沉默子Poly(A
2、)加尾信号反式作用因子基因基因分类分类.6基因组基因组完整的单倍体序列完整的单倍体序列基因组（基因组（Genome）：）：指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。人类基因组（人类基因体）：人类基因组（人类基因体）：是指人的基因组，由23对染色体组成，其中包括22对体染色体、1条X染色体和1条Y染色体。人类只有一个基因组，大约有2-3万个基因。人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，.7人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划概述人类基因组计划概述目的与意义目的与意义人种自传人种自传23章章遗传图谱遗传图谱.8人类基因组计划人类基因组计划概述概述人类基因组计划人类基因组计划(
3、human genome project,HGP)：是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。意义：意义：人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。被誉为生命科学的“登月计划”。中国：中国：中国于1999年9月积极参加到这项研究计划中的，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约3000万个碱基对的测序任务。中国因此成为参加这项研究计划的唯一的发展中国家。.9人类基因组计划人类基因组计划概述概述目的：目的：揭开组成人体2.5万个基因的30亿个碱基对的秘密；方法：方法
4、：要发现所有的人类基因，找出它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，同时绘制出人类基因的图谱。结果：结果：2001年人类基因组工作草图的发表（由公共基金资助的国际人类基因组计划和私人企业塞雷拉基因组公司各自独立完成，并分别公开发表）被认为是人类基因组计划成功的里程碑。截止到2005年，人类基因组计划的测序工作已经完成。意义：意义：解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、1.为疾病的诊治提供科学依据。.101号染色体生命。讲生命的诞生，来源。2号染色体物种。人类发展和近亲之间的分别。3号染色体历史。
5、孟德尔以及其他科学家在遗传学上做出的贡献。4号染色体命运。你的命运完全在你的基因里。5号染色体环境。推翻让读者觉得基因是简单的分割开来的。6号染色体智慧。基因的存在不是为了致病的7号染色体本能。解释行为遗传学和进化心理学结论对人类的影响。8号染色体和9号染色体X和Y染色体冲突。性染色体，同性恋是否遗传。8号染色体自身利益。基因组97%都不是真正的基因。基因指纹测试技术。9号染色体疾病。解释了血型的不同以及基因对疾病的抵抗力。10号染色体压力。外部事件对基因的影响。11号染色体个性。性格的天生以及后天对性格的影响。12号染色体自我组装。基因是编制好的一连串程序，自我运行功能。13号染色体史前。你
6、知道你为什么能消化牛奶?你祖宗几千里以前就学会了“偷奶”。14号染色体永生。寿命长短实在不好说。万一哪个基因调皮一下，你就挂了。15号染色体性别。你出生真不是自个儿决定的事，是男是女，你爸妈也没法决定。16号染色体记忆。想知道为嘛你记东西老是学完就忘么。17号染色体死亡。癌症啊!癌症啊!18号染色体历史。基因工程这玩意儿。19号染色体预防。你又想知道，你又不想知道。20号染色体政治。无知导致的悲剧。21号染色体优化人种论。优化人种的历史和现在遗留下来的歧视。22号染色体自由意志。休谟之叉：我们的行为要么是事先已经被决定了的，这样我们就不必为它们负责;要么是偶然事件的结果，这样我们也不必为它们负
7、责。人人种种自自传传23章章.11人类基因组计划人类基因组计划四大遗传图谱四大遗传图谱 转录图谱转录图谱遗传图谱遗传图谱物理图谱物理图谱序列图谱序列图谱.12遗传图谱：遗传图谱：又称连锁图谱（linkage map），它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。.13物理图谱：物理图谱：是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(
8、Mb)的图谱。.14序列图谱（序列图谱（sequence map）：）：序列分析采用一个区域的DNA序列重叠群使测序工作不断延伸，使用其中的序列标记位点STS作为两个片段间的重叠区域，使分别被测序的短序列进行正确的拼接，最后获得DNA全序列图谱。.15转录图谱（转录图谱（transcriptome map）：）：是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。在人类基因组中鉴别出占具2%5%长度的全部基因的位置、结构与功能，最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位置。.16基因测序基因测序触手可及触手可及.17测序技术测序技术DN
9、A测序：测序：是对DNA分子的一级结构的分析。意义：意义：分析基因组核苷酸排列序列分析基因序列基因定点诱变的基础基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础确定DNA序列中蛋白质的编码区历程：历程：第一代测序技术：双脱氧链终止法、化学降解法第二代测序技术：焦磷酸测序、连接酶测序第三代测序技术：单分子荧光测序1.第四代测序技术：纳米孔测序.18测序技术测序技术发展历程发展历程.19第一代测序技术第一代测序技术第一代测序技术的主要特点：第一代测序技术的主要特点：优点：优点：测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，从头测序，从头组装缺点：缺点：测序成本高，通量低，难以大规模的应用.20第
10、一代测序技术第一代测序技术双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法原理：原理：由于ddNTP的2和3都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列缺点：缺点：1、测定步骤繁琐。一个步骤重复四次，因此需要大量相同的DNA 拷贝，样本需求量大；2、不能测定太长的DNA 序列。意义：意义：Sanger测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基。自
11、此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。.21.22第一代测序技术第一代测序技术化学降解测序法化学降解测序法原理：原理：先对待测DNA末端进行放射性标记，再通过4-5组相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生4-5 组不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记
12、的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。.23第二代测序技术第二代测序技术特点：特点：大大降低了测序成本的同时，大幅提高了测序速度，持了高准确性，序列读长方面起第一代测序技术则要短很多。.24第二代测序技术第二代测序技术Roche 454测序系统测序系统DNA文库制备：文库制备：利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库。.25第二代测序技术第二代测序技术Roche 454测序系统测序系统Emulsion PCR（乳液（乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）：，其实是
13、一个注水到油的独特过程）：将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。.26第二代测序技术第二代测序技术Roche 454测序系统测序系统焦磷酸测序：焦磷酸测序：测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信
14、号处理而获得最终的测序结果。.27第二代测序技术第二代测序技术Illumina边合成边测序边合成边测序过程：过程：DNA待测文库构建：超声波打断为200-500bp序列片段，并添加接头；Flowcell，吸附流动DNA片段桥式PCR扩增与变性：碱基的信号强度放大1.测序：原理同Sanger.28第二代测序技术第二代测序技术Solid技术技术DNA文库构建：文库构建：片段打断并在两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。Emulsion PCR：小水滴emulsion PCR，微珠只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3修饰的微珠会被沉积在一块玻
15、片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。.29第二代测序技术第二代测序技术Solid技术技术连接酶测序：连接酶测序：没有采用DNA聚合酶，而采用了连接酶。其底物是8碱基单链荧光探针混合物，将其表示为：3-XXnnnzzz-5。探针的5末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。.30第
16、三代测序技术第三代测序技术单分子测序技术单分子测序技术案例：案例：PacificBiosciences公司 RS系统特点：特点：不需要PCR扩展，消除了潜在的扩展错误和不均匀。可以直接阅读RNA的序列。例如：Helicos直接使用RNA反转录酶，边RNA反转录合成边测序。可以直接阅读包括甲基化在内的DNA修饰。例如：Pacbio使用甲基化和非甲基化碱基的合成速率上的差异来进行区分。读长更长。PacBio系统可以测到1000bp以上。1.速度更快。.31第三代测序技术第三代测序技术PacBio SMRT技术技术原理：原理：对零模波导中的单个荧光分子进行高灵敏度检测，从而快速获得DNA序列信息。D
17、NA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。.32第四代测序技术第四代测序技术纳米孔测序技术纳米孔测序技术原理：原理：分子在通过纳米孔道时，会对通过纳米孔的电流，或横穿过纳米孔的电流（隧穿电流）产生影响，而每种不同的分子通过时，对电流产生的影响具有可区别的差异。于是利用这种差异，纳米孔测序技术就可以识别基因中碱基（对）的排列顺序。.33第四代测序技术第四代测序技术纳米孔测序技术纳
18、米孔测序技术特点：特点：物理方法，无需生物化学预处理，直接对DNA进行读取；真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法；完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程；成本低廉：最有希望实现1000美元基因组甚至100美元基因组的技术，超高读长；高通量；易集成，小型化；速度快，测序时间更少；数据分析更为简单；1.实现了从低读长到超高读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越。.34其他测序技术其他测序技术Ion Torrent原理：原理：布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中PH发生改变，位于池下离子感受器感受到H
19、+信号，H+信号再转化为数字信号。.35其他测序技术其他测序技术Ion Torrent文库和样本制备跟454技术很像，只是测序过程中通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。.36其他测序技术其他测序技术Ion Torrent特点：特点：Ion Torrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。.37基因测序基因测序主流测序平台价格对照表主流测序平台价格对照表.38微生物组测序个体基因组测序宏基因组测序全基因组测序16srDNA测序.39
