1、第十二章色谱分离色谱分离又称层析分离 1）利用各组分物理化学性质的差别 2）使各组分不同程度的分布于流动和固定的两相中 3）造成各组分的移动速度产生差别 使各组分相互分离。特点：特点：（1 1）纯化倍数高纯化倍数高（2 2）操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难（3 3）终产品纯化终产品纯化（4 4）适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品 色谱分离包括一个流动相（气相或液相）和一个固定相，色谱分离包括一个流动相（气相或液相）和一个固定相，分离的基础是组分的分离的基础是组分的差速迁移差速迁移。在色谱柱中流动相沿固定相。在色谱柱中流动相沿固定相流动，混合物中各组分在此固定相与流动相间的分配不同
2、，流动，混合物中各组分在此固定相与流动相间的分配不同，在固定相中相对量多的组分，与固定相在一起的时间分率大，在固定相中相对量多的组分，与固定相在一起的时间分率大，随流动相一起流动的速度就慢。这样，由于混合物中各组分随流动相一起流动的速度就慢。这样，由于混合物中各组分被固定相滞留的程度不同，它们随流动相移动的速度就不同被固定相滞留的程度不同，它们随流动相移动的速度就不同（称为差速迁移），随流动相移动快的组分先离开色谱柱，（称为差速迁移），随流动相移动快的组分先离开色谱柱，随流动相移动慢的组分后离开色谱柱，因而可使混合物的各随流动相移动慢的组分后离开色谱柱，因而可使混合物的各组分互相分离。组分互相
3、分离。第一节 色谱分离的分类一、根据分离机理分类1、根据分离机理分类 吸附色谱 依靠对固体的吸附作用。分配色谱 依靠溶质在液液两相的溶解分配 离子交换色谱 依靠离子交换作用 位阻排斥色谱 依靠多孔固体或凝胶的排斥效应 亲和色谱 依靠生物分子的专一性结合 StationaryphaseMobilephaseOne Plate of SeparationLLLADSORPTION PARTITIONLiquid-SolidLiquid-LiquidABC（色层分析法的基本原理：非极性极性非极性极性两相系统样品分子依据分子极性选择性进入流动相或固定相样品样品样品凝胶过滤法：樣本樣本固固定定相相流流动
4、动相相小分子被延滯大分子流出較快小分子大分子Stokes radius分子大小、形狀凝胶过滤法的洗脱图谱：XYZVoVeAEnzyme activityVt0EVo 之前不應有物質溶離出來Vt 之後不應有物質溶離出來NaClEl ut i on Vol ume(mL)目標酵素(E)最好不要落在主要蛋白質峰(Y)的範圍內目标酶（E）最好不要落在主要蛋白质峰（Y）的范围内V0之前不应有物质洗脱出来Vt之后不应有物质洗脱出来载 体+样品分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子+离子交換法 Anion Exchange 选择离子交換介質Buffer pH76891043+-0Net Cha
5、rge of a Prot ei npI陰離子交換陽離子交換5亲和层析法四項要素Sol i d M at ri xC oupl i ngR eact i onEl ut i onLi gand(A)Speci f i cBi ndi ngSubst ance(B)BA(3)(1)(2)(4)配 体雜 質溶 離耦合反應BBB耦合反应杂质洗脱 亲和层析法的作用机理：Sam pl eABBEl ut i onW ashi ng(1)(2)(3)BAA固相擔体親和基團 配體XX亲和基团配体固相载体Ni固相载体Metal Chelate Affinity ChromatographyHis HisHis
6、Protein 金属螯合层析法：2、按固定相形状不同分类 柱色谱 分离体系采用圆柱管 空柱色谱 色谱柱是空心无阻碍的中心通道形色谱 纸上色谱 固定相是滤纸或将固定相载于纸上 薄层色谱 固定相是一层吸附剂物料，平铺于惰性平板上 3、按流动相和固定相分类 气相色谱 流动相是气体 液相色谱 流动相是液体 超临界色谱 流动相是超临界流体4、按色谱操作分类 迎头或前沿色谱 以阶梯进料的形式操作 冲洗色谱 连续加入冲洗剂，脉冲进料 置换色谱 在前沿色谱的基础上，用吸附能力最强的组分置换 程序升温色谱 床层温度升高，吸附等温线的斜率减小，有规则的升高色谱柱的温度，有利于吸附力强的组分脱附 阶梯淋洗色谱 用不
7、同离子强度(如pH值或盐浓度等)的溶液有规律地冲洗床层，使性质接近的离子或组分得以分离。5、根据操作压力的不同分类 低压色谱 0.5MPa 中压色谱 0.5 5MPa 高压色谱 5 50MPa 第二节 生物工业中的色谱分离 一、色谱分离的规模 色谱分析：20g/d二、色谱分离方法的选择 选择不同的色谱分离方法的依据：1）目的产物的分子结构、物理化学特性及分子量的大小。2）主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相接近的杂质的成分与含量。3）目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。三、分析色谱与制备色谱和工业色谱的比较 1）应用色谱技术范围的不同 2）操作上的不同 3）色谱分离理论上
8、的不同 理论塔板数的不同 2 分配系数的不同 3 样品保留值与峰高的不同 第四节 色谱分离的基本原理在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为洗脱时从柱中流出的溶液称为展开后各组分的分布情况称为一、分配色谱 是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离，其过程相当于连续性的溶剂抽提。(一)分配系数 在一定条件下，一定量的溶质在两种互不相溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种中的浓度之比为一常数，此常数称为(二)阻滞因数 溶质在色谱柱(纸、板)中的移动速率与流动相移动速率之比称为，以Rf表示，因而也称为Rf值。Rf=1，溶质不溶于固定相 Rf=0，溶质不溶于流动相 0Rf1
9、，Rf越大，溶质随流动相流动的速度越快(三)塔板理论 同化工原理中的蒸馏操作一样，色谱柱的分离效率也可用塔板理论来描述。二、吸附色谱 吸附现象是表面的一个重要性质之一。固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分于所受的吸引力不相等。表面层所受的作用力小，因而溶质分子在流动过程中碰到固体表面时受到表面剩余力的影响，被吸附而停留下来。吸附色谱可分为无机基质吸附色谱(多种作用力)、疏水作用吸附色谱(疏水作用)、共价作用吸附色谱(共价键)、金属整合作用吸附色谱(整合作用)、聚既胺吸附色谱(氢键作用)等。此外，离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，(一)等温曲线 吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在
10、两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。(二)解离常数与分离因数 在反应工程中，人们习惯于应用解离常数来讨论分子间的相互作用。三、凝胶色谱分离 凝胶色谱分离具有许多特点：(1)凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好；(2)、应用范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的分子；(3)设备简单，易于操作，周期短，层析剂不需再生即可反复使用，有的可连续使用几百次至上千次。这些优点使凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。第五节 柱色谱分离法 工业规模的色谱分离大
11、多采用柱色谱分离法，而且吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行，它们的实验装置和操作方法也基本类似。一、层析剂 用于色谱分离技术中的固定相或分离介质，总称为。它由和团(或活动中心)组成。其中，层析剂的基质材料应为化学惰性物质，与目的产物和杂质都无结合作用；活性官能团则根据所用色谱分离方法选用或者制取。生物产品所需固定相或层析剂应具有下列特性：(1)不溶于流动相，且具有较好的化学稳定性和机械强度；能经受使用、清洗和再生时的各种环境条件；对于生物活性物质的分离，还必须能耐受生物降解作用。(2)具有较大的表面积和孔隙度，且粒度、孔径分布均匀。(3)有较高的回收率和负载量
12、，能达到所需的分离效率，且重现性好。(4)有些分离过程，层析剂使用前后需要高压消毒，此时层析剂应具有较好的热稳定性。(5)无毒性，分离过程不引起目的产物的变性或失活。(6)成本较低，价格合理。层析剂的分类方法很多：1）按化合物的种类可分成无机基质层析剂和有机基质层析剂两大类；2）按色谱分离机理可分成吸附、分配、离子交换、凝胶和亲和层析剂5类；3）按形状可分成球形和无定形两类；4）按硬度可分成硬质层析剂、半硬质凝胶层析剂及一些如琼脂糖的生物软胶；5）按结构可分成表面多孔薄层层析剂和完全多孔层析剂(一)无机基质层析剂 无机基质层析剂常用的基本材料有、等。将这些无机材料制成适宜应用的球形或无定形颗粒
13、，可直接用于吸附和正相分配色谱。其中有些无机材料经化学修饰或涂层改性后，可制成不同分离机理的层析剂，以满足不同的分离目的。(二)有机基质层析剂 与无机基质比较，有机基质材料具有如下特征：(1)基质微粒可广泛选择单体和交联剂聚合进行化学改性处理，所合成的层析剂产品普遍具有良好的选择性；(2)层析剂负载能力强，有较高的色谱容量；(3)具有良好的化学稳定性，可在广泛的pH范围内使用；(4)不易产生不可逆的吸附作用，特别是对于生化物质的分离能较好地保存其生物活性。有机基质的不足之处在于机械强度较低，孔结构复杂，洗脱时体积会变化。膠体粒子的粗細影溶离液的流动：膠体的顆粒越小 其解析力越大 但流速變慢30
14、m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect 溶离液是以扩散方式进出胶球：溶離液或樣本分子，由膠体粒子外圍均勻向內或外擴散。D Di i f f f f u us si i o on n D Di i s sp pe er rs si i o on n 洗脱液对胶球的扩散：若膠体粒子太大，則由外圈擴散到內部的距離長，通過粒子所需要的時間拉長，降低分離效果。Di sper si on(瀰散)方式的膠体因通透性佳，溶離液可直接流入膠体，不再靠擴散作用。二、装置 柱色谱装置般由、等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。(一
15、)进样及流动相供给装置 在制备型和工业型高效液相色谱中，流动相供给部分一般包括、及。(1)具有较高的输出压力。层析剂颗粒越细，色谱柱越长，流动相粘度越大，所需高压泵的输出压力就越高。(2)能使流动相以均匀的流速进入色谱柱，脉冲式进料会使分离效果下降。(3)耐腐蚀性强。(4)泵的死角体积小，以便于迅速更换流动相和梯度洗脱。是流动相供给的关键设备，分和两种基本类型。无论采用哪种泵都必须满足下列基本要求：(二二)色谱往色谱往 通常用玻璃柱，这样可直接观察色带的通常用玻璃柱，这样可直接观察色带的移动情况，柱应该平直，直径均匀。移动情况，柱应该平直，直径均匀。柱的入口端应有柱的入口端应有，使进入柱内的流
16、，使进入柱内的流动相分布均匀并有规则的流型。柱的动相分布均匀并有规则的流型。柱的用以支持固用以支持固定相。柱的定相。柱的应该尽量短些，这样可以避免已应该尽量短些，这样可以避免已分离的组分重新混合。在分离生物物质时，有些色谱分离的组分重新混合。在分离生物物质时，有些色谱柱需带有柱需带有，以保持操作过程能在适宜的温度下进，以保持操作过程能在适宜的温度下进行。还有些柱应能进行行。还有些柱应能进行，以免微生物的污染。，以免微生物的污染。柱的与成正比，与柱的成反比，因此色谱柱通常是细长的。的增加可使样品成平方地增加，但柱径大时，流动很难均匀，色带不易规则，因而分离效果差；柱径太小时，进样量少，且使用不便
17、，装柱困难。色谱柱的长度与许多因素有关，包括、，等。就目前采用的匀浆填装技术，填装长度一般不能超过50cm。而大多数色谱柱的长度在25cm左右。X尚未沉降已堆積12膠体清洗膠体靜置膠体裝填膠体加壓流洗沉降緊密溫度平衡預估体積暫停流洗緩衝液平衡adapt orreservoi r 层析柱的裝填方法预估体积清洗凝胶缓冲液平衡 温度平衡静置凝胶胶体装填凝胶暂停流洗已堆积尚未沉降加压流洗 沉降紧密 液相柱层析系统緩衝液管柱梯度製造器幫浦監視器記錄器分劃收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapt orreservoi r膠體裝填膠體A缓冲液 梯度混合仪 分步收集器 监视器凝胶床体记录器蠕动泵(三)检
18、测器与流分收集器 通过连续监测柱底出口处液体中各组分的浓度变化，可以了解样品中组分的分辨情况。根据组分的物理化学特性，例如、以及等，选用适当的仪器，进行在线检测。是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器。有、等若干种。其中以和较为方便实用。在以相对密度不同的洗脱剂依次洗脱时，一般更为有利。三、操作技术(一)样品溶解与进样方法 1）采用色谱方法分离和纯化生物大分子物质时，是成败的关键之一。蛋白质类样品的溶解度有限，通常需加其他试剂，以增加它们在水中的溶解度。2）溶剂的性质也必须适应所用的固定相，以达到“活塞式”进样的目的。3）适宜的进料方法(二)展开操作 样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离
19、并收集目的产物。下面将介绍几种常用的展开方式。1洗脱展开法 洗脱展开法是展开操作中应用最广的一种方法。操作时，先将样品输入色谱柱，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。在洗脱过程中，各组分因与固定相的作用力不同而分离，并随溶剂向下移动，最后有顺序地全部流出色谱柱。根据洗脱过程中洗脱剂的组成是否改变，洗脱展开法可分为如下3种。1）恒定洗脱法 恒定洗脱法在整个洗脱过程中不改变洗脱剂的组成。2）逐次洗脱法 此法在洗脱过程中，洗脱剂的组成至少改变一次。3）梯度洗脱法 所谓梯度洗脱法就是逐渐改变洗脱剂的组成，使洗脱条件更有利于混合物的分离，从而消除重叠峰现象。2前沿分析法
20、 在前沿分析法中，样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，即样品溶液本身起流动相的作用。只能得到其中作用最弱的纯物质，不能用于混合物的分离。3置换展开法 置换展开法又名顶替法或取代法。置换展开法与洗脱展开法差别不大，其主要的不同之处是样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。四、洗脱色谱动力学（略）五、径向色谱（为解决大直径色谱柱分离效果较差的问题）径向色谱柱的结构及原理如图所示。在径向色谱住中，样品和流动相是从柱的圆周围流向柱圆心。径向色谱有以下特点：1）可在较小的柱床层高度时使用较大的流动相流速；2）圆柱表面积一般大
21、于其横截面积，所以在流动相保持较高的体积速率时，反压降较低；3）当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，可以线性增大样品处理量，样品的规模可在保持相似的色谱条件下直接放大，各组分的保留时间及分辨情况与小试时完全相同。亲和色谱 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点是，具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。亲和色谱的局限性在于不是任何生物高分子都有特定的配基，针对某一分离对象需要制备专一的配基和选择特定的色
22、谱条件。在亲和色谱分离法中，经常被采用的生物亲和关系如下：酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；抗体：抗原、病毒、细胞；激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。根据亲和色谱选择性的高低，可将亲和色谱分为专一性和基团性两大类。专一性的配基仅对某种生物物质有特别强的亲和性。基团性的配基则指固定相配基对一类基团有极强的亲和关系，能与许多需要这些辅酶才起催化作用的酶(各种脱氢酶、激酶等)发生亲和结合。基团性亲和色谱具有实用意义，它可以扩大亲和色谱的适应范围.二、
23、亲和层析剂 亲和层析剂的制备过程一般包括3步，即载体(基质)的选择、载体的活化和配基的连接。亲和色谱的理想载体应具有下列特性：不溶性；渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过；高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状；最低的吸附力；较好的化学稳定性；抗微生物和酶的侵蚀；亲水性；具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。三、亲和色谱操作中的洗脱方法 亲和色谱一般采用柱色谱法。由于生物大分子与配基的作用形式是多种多样的，因此，它们的洗脱条件通常需要通过实验获得。在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。专一性洗脱法是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。
