1、1产前诊断实验室技术郑州大学第三临床医学院 检验科 吴玥丽2015年04月2主要内容一、产前诊断基本知识介绍二、产前诊断的取材三、产前诊断主要实验室技术l羊水细胞染体核型分析l羊水细胞荧光原位杂交3为什么要进行产前诊断围生儿期常见疾病的发生率大大降低遗传性疾病的发生率逐年提高遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚至导致患儿死亡或终生残疾产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生，降低遗传性疾病的发生率 4产前诊断概念l 产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准确判断产前诊断产前诊断无创性产前诊断技术无创性产前诊断技术有创性
2、产前诊断技术有创性产前诊断技术5产前诊断概念l 无创性产前诊断技术n影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发育情况n母体外周血富集胎儿细胞技术n母体外周血胎儿游离DNA检测l 有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）n绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作n获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病6可进行产前诊断的疾病有哪些单基因遗传病:PCR，基因测序等遗传病染色体病：染色体核型分析金标准！荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）多基因遗传病：疾病易感基因研究基因组病：SNP-array,array-
3、CGH7染色体异常的发生机率l活产婴儿 0.6%n先天性智力障碍（MR）患者 23%n先天性心脏病 13%l死胎和围产期死亡胎儿 6.0%l自然流产(前三个月)60%8染色体异常的发生机率l 21-三体综合征新生儿发病率高达三体综合征新生儿发病率高达1/800l 18-三体发病率约为三体发病率约为1/8000l 13-三体发病率约为三体发病率约为1/20000l 其它各种性染色体异常发病率约为其它各种性染色体异常发病率约为1/10009哪些人需要进行产前诊断l 唐筛高风险孕妇l 35岁以上高龄孕妇l 夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者l 曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠l 曾有不明
4、原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新生儿死亡史的孕妇再次妊娠l 采用辅助生殖技术妊娠者l 夫妇一方有明显致畸因素接触史者10孕期胎儿染色体筛查方案11唐氏筛查报告的解读l 例如：21-三体风险率1/100l 假阳性和假阴性结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率:65%，假阳性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以将检出率增加到75%结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率：5%l 仅仅是筛查实验，不是确诊实验！12先天愚型的发生率与母亲年龄关系母亲生育年龄（岁）母亲生育年龄（岁）出生先天愚型患儿出生先天
5、愚型患儿风险率风险率曾生育过先天愚型患儿曾生育过先天愚型患儿孕妇再发风险孕妇再发风险201/1850增加增加5倍即倍即1/37020-251/1600增加增加5倍倍 即即1/320 25-301/1350增加增加5倍倍 即即1/270 30-351/800 增加增加5倍倍 即即1/160 35-401/260 无明显增加无明显增加40-451/100无明显增加无明显增加451/50无明显增加无明显增加13产前诊断取材l绒毛膜穿刺术l羊膜腔穿刺l脐静脉穿刺术14绒毛膜穿刺术l 在妊娠9-11周之间进行l 一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何产前诊断的需要l 操作相关的流产率约为1%1
6、5羊膜腔穿刺术l孕18-24周lB超引导下l取羊水25-30ml16脐静脉穿刺术l 操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为最佳穿刺时期l 其危险性高于羊膜腔穿刺术和CVS17产前诊断主要实验室技术l羊水细胞培养及染色体核型分析l羊水细胞荧光原位杂交检测（Fluorescence in situ hybridization，FISH）18羊水细胞培养及染色体核型分析19羊水细胞培养实验原理l 标本采集：一般为孕1824 周，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，较易生长l 羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的，死亡的，只有一小部分是活细胞l 人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并
7、可连续进行传代培养20羊水细胞培养实验原理l 培养条件：37,5%CO2 开放式培养l 经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞克隆，此时需更换培养液l 换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况，适时加入秋水仙素终止培养21羊水细胞培养实验步骤l 25ml羊水于1500rpm离心10minl 小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀l 加入5ml完全羊水培养基，混匀l 转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37,5%CO2 培养箱中培养57天l 一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视
8、情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时l 如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左右行细胞学处理。22细胞收获及染色体制备实验步骤l 倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中l 0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化l 收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清l 低渗：加入0.075M KCl 6ml，吸管吹打，37水浴30minl 预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm离心10minl 固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀，150
9、0rpm离心10minl 重复固定一次，1500rpm离心10min，去上清l 根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片l 显带、染色，显微镜下分析23正常男性染色体核型正常男性染色体核型 正常女性染色体核型正常女性染色体核型2421-21-三体男性染色体核型三体男性染色体核型 21-21-三体女性染色体核型三体女性染色体核型25羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测l 原理：l 经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置上发出荧光信号l 在细胞学水平和分子水平之间架起了一道桥梁26荧光原位杂交（FISH）技术用已知的荧光标记单链核苷酸为探针，按
10、照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位27羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测荧光标记的DNA探针28FISH技术可检测哪些染色体病l 羊水FISH检测技术可快速检测羊水细胞中13、18、21、X、Y染色体数目异常l 以上五种染色体非整倍体异常发生率占所有染色体非整倍体发生率65%以上，占染色体异常活婴的95%以上 29FISH试验流程羊水细胞处理：低渗、固定、滴片玻片预处理玻片变性，打开DNA双链荧光探针配置探针变性，打开DNA双链
11、玻片置于湿盒中42 恒温孵育箱中杂交过夜（1418小时）洗片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察荧光信号30图1 A：正常男性核型图；B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y核型分析与FISH结果 图图1A 1B 1C1A 1B 1C31核型分析与FISH结果图2 A：正常女性核型图；B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X 图图2A 2B 2C2A 2B 2C32核型分析与FISH结果 图图3A 3B 3C3A 3B 3C图3 A：21-三体
12、男性核型图（箭头示三条21号染色体）B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号（3个）C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y33核型分析与FISH技术对比l 核型分析核型分析优点优点n可检出全部46条染色体n不仅能检出染色体数目异常，还能检出染色体结构异常n目前仍是诊断染色体病的金标准l 核型分析核型分析缺点缺点n孕周要求较为严格，一般为18-24周 n需要经过细胞培养，诊断周期长，核型分析报告时间为15-20天 n可能发生污染或培养失败等情况 34l FISH技术技术优点优点n不经过细胞培养，缩短了诊断时间，提高了诊断效率，报告时间为2-3天n 对孕周无
13、严格要求n操作简便、敏感、特异性强 l FISH技术技术缺点缺点n仅能检出部分染色体数目异常n不能检出染色体结构重排及变异核型分析与FISH技术对比侵入性产前诊断技术的利与弊3547,XY,+21 利：目前的金标准 弊：一定的流产风险：0.5%报告周期长，存在培养风险 孕妇和家属承受较大思想压力无创性产前检测技术36无创性产前检测技术3738无创性产前诊断技术39无创性产前检测技术的利与弊产前诊断新技术l 高通量基因测序l 染色体微阵列（CMA，SNP-array）l分辨率高，是普通核型分析的20倍l可检出重复或缺失序列的来源l不能检出染色体平衡性结构改变l不能检出重复或缺失序列在染色体组中的位置41产前诊断的重要性42本节知识回顾l 产前诊断的概念l 产前诊断的主要实验室技术l羊水细胞培养及染色体核型分析l羊水细胞荧光原位杂交43
