1、原核生物基因表达调控原核生物基因表达调控生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室李长燕李长燕Tel:66930293email:转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质DNA RNA（病毒）（病毒）复制复制复制复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒）逆转录逆转录中心法则（中心法则（The central dogma）:mRNA,tRNA,rRNA蛋白质是生物体功能的执行者蛋白质是生物体功能的执行者2006Science 200720082009 遗传密码（遗传密码（genetic codegenetic code）：是联系核酸的：是联系核酸的碱基序列和蛋白质氨基酸序列的途径。由三碱基序
2、列和蛋白质氨基酸序列的途径。由三个碱基代表一种氨基酸，称为密码子（个碱基代表一种氨基酸，称为密码子（codoncodon）或三联体（或三联体（triplettriplet）。）。遗传密码遗传密码2020种氨基酸由种氨基酸由6464组密码子编码组密码子编码 4 42 2=16=16 4 43 3=64=64 4 44 4=256=256v4 4种碱基可以组合成种碱基可以组合成6464种密码子，而体内只有种密码子，而体内只有2020种氨基种氨基酸，故存在多个密码子代表一种氨基酸的情况。酸，故存在多个密码子代表一种氨基酸的情况。遗传密码的基本特性遗传密码的基本特性 无标点符号：无标点符号：两个密码子
3、之间没有任何起标点符号两个密码子之间没有任何起标点符号作用的密码子加以隔开。要正确阅读密码必须按一作用的密码子加以隔开。要正确阅读密码必须按一定的读码框架，从一个正确的起点开始，一个不漏定的读码框架，从一个正确的起点开始，一个不漏的挨着读下去，直到碰到终止信号为止。若插入或的挨着读下去，直到碰到终止信号为止。若插入或删去一个碱基，就会使这以后的读码发生错误，称删去一个碱基，就会使这以后的读码发生错误，称为移码。由于移码引起的突变称为移码突变为移码。由于移码引起的突变称为移码突变 非重叠性：非重叠性：多数生物中读码规则是不重叠的，少数多数生物中读码规则是不重叠的，少数噬菌体中有重叠现象。噬菌体中
4、有重叠现象。简并性：简并性：除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸均有两种以上的密码子。多种密码子编码一种氨均有两种以上的密码子。多种密码子编码一种氨基酸的现象称为简并基酸的现象称为简并(degeneracy),(degeneracy),代表一种氨代表一种氨基酸的密码子称为同义密码子基酸的密码子称为同义密码子(synonyms)(synonyms)。摆动性（摆动性（wobble)wobble)：密码子中第三位碱基具有较密码子中第三位碱基具有较小的专一性，密码子的简并性只涉及第三位碱基。小的专一性，密码子的简并性只涉及第三位碱基。密码子的专一性主要由头两位碱基决定，
5、第三位密码子的专一性主要由头两位碱基决定，第三位碱基的重要性不大。碱基的重要性不大。遗传密码的基本特性遗传密码的基本特性 终止密码子终止密码子：UAG,UAA,UGA.UAG,UAA,UGA.起始密码子起始密码子：AUG,GUG(AUG,GUG(原核生物原核生物中）中）.密码子通用与例外密码子通用与例外：在所有的生物体中，密码子字典几乎是：在所有的生物体中，密码子字典几乎是通用的，这已被体内和体外翻译实验所证明。也有极少数例通用的，这已被体内和体外翻译实验所证明。也有极少数例外的情况。如在山羊枝原体（外的情况。如在山羊枝原体（Mycoplasma capricolumMycoplasma ca
6、pricolum），），UGAUGA不是终止密码子，而代表色氨酸。在有些种类的纤毛虫，不是终止密码子，而代表色氨酸。在有些种类的纤毛虫，UAAUAA和和UAGUAG代表的是谷胺酰胺而不是终止密码子。在假丝酵母代表的是谷胺酰胺而不是终止密码子。在假丝酵母（CandinaCandina），），GUGGUG是丝氨酸而不是亮氨酸的密码子，这是目是丝氨酸而不是亮氨酸的密码子，这是目前发现的唯一的编码密码子的改变。线粒体的遗传密码存在前发现的唯一的编码密码子的改变。线粒体的遗传密码存在较多的例外情况，较多的例外情况，UGAUGA由终止密码子变为色氨酸的密码子。由终止密码子变为色氨酸的密码子。遗传密码的基本
7、特性遗传密码的基本特性蛋白质合成组分蛋白质合成组分（一）（一）mRNAmRNA 翻译的模板翻译的模板 翻译是从翻译是从mRNAmRNA的的5 5端向端向3 3端进行的。端进行的。蛋白质的合成是从氨基端到羧基端。蛋白质的合成是从氨基端到羧基端。mRNAmRNA分子起始密码子上游含有一段特殊的分子起始密码子上游含有一段特殊的核糖体结合位点。核糖体结合位点。原核生物中原核生物中mRNAmRNA的转录与蛋白的翻译是同的转录与蛋白的翻译是同时进行的时进行的蛋白质合成组分蛋白质合成组分（二）（二）tRNAtRNA tRNA tRNA 是起具体翻译作用的分子。在翻译中转运氨是起具体翻译作用的分子。在翻译中转
8、运氨基酸，将氨基酸经过密码子与反密码子间的相互基酸，将氨基酸经过密码子与反密码子间的相互识别定位在肽链中。所有的识别定位在肽链中。所有的tRNAtRNA分子都有相同的分子都有相同的二级（三叶草形）和三级（倒二级（三叶草形）和三级（倒L L形）结构。这种结形）结构。这种结构上的一致是其功能所必需的，因为不同的构上的一致是其功能所必需的，因为不同的tRNAtRNA分子有相同的功能特征，如均能和核糖体的分子有相同的功能特征，如均能和核糖体的A A和和P P位结合；能被翻译因子（位结合；能被翻译因子（EF-TuEF-Tu或或eEF1eEF1）识别。）识别。tRNAtRNA 密码子与反密码子（antic
9、odon）间的正确识别是遗传信息正确传递的保证。在生物体中，tRNA的种类要少于编码氨基酸的密码子（61种），要识别这些密码子，必然存在一种反密码子识别多种密码子的现象。）。这是因为tRNA分子上的反密码子与密码子的配对具有摇摆性。密码子与反密码子碱基的摆动配对密码子与反密码子碱基的摆动配对反密码子反密码子的第一个的第一个碱基碱基可识别密码可识别密码子的第三个子的第三个碱基碱基反密码子的反密码子的第一个碱基第一个碱基可识别密码可识别密码子的第三个子的第三个碱基碱基UIAA或或GU，C或或AUCGGC或或UtRNAtRNA分子上与多肽合成有关的位点分子上与多肽合成有关的位点 3 3端端CCACC
10、A上的氨基酸接受位点上的氨基酸接受位点 识别氨酰识别氨酰tRNAtRNA合成酶的位点合成酶的位点 核糖体识别位点核糖体识别位点 反密码子位点反密码子位点 mRNAmRNA结合位点结合位点tRNAtRNA在识别在识别mRNAmRNA分子上的密码子时，具有接头的作用。氨基酸一旦与分子上的密码子时，具有接头的作用。氨基酸一旦与tRNAtRNA形成氨形成氨酰酰tRNAtRNA后，进一步的去向就由后，进一步的去向就由tRNAtRNA来决定了。来决定了。蛋白质合成的组分蛋白质合成的组分（三）核糖体（三）核糖体 核糖体（核糖体（ribosomeribosome）是翻译进行的场所，提供蛋是翻译进行的场所，提供
11、蛋白质合成过程中所需的各种生物活性因子。在一白质合成过程中所需的各种生物活性因子。在一个生长旺盛的细菌中，约有个生长旺盛的细菌中，约有20 00020 000个核糖体。其个核糖体。其蛋白成分占细菌总蛋白的蛋白成分占细菌总蛋白的10%10%左右；左右；RNARNA成分占细成分占细菌总菌总RNARNA的的80%80%左右。核糖体的数目与细胞蛋白质左右。核糖体的数目与细胞蛋白质合成的活性密切相关。细菌的核糖体与合成的活性密切相关。细菌的核糖体与mRNAmRNA、DNADNA相连；真核细胞的核糖体与内质网或细胞骨架相相连；真核细胞的核糖体与内质网或细胞骨架相连。核糖体由大小两个亚基组成。连。核糖体由大
12、小两个亚基组成。原核细胞核糖体的原核细胞核糖体的30S30S亚基亚基含含2121种蛋白种蛋白(S1-S21)(S1-S21)及一分子及一分子16SrRNA.16SrRNA.50S50S亚基亚基中含有中含有3434种种蛋白蛋白(L1-L34)(L1-L34)及及5S,23S rRNA5S,23S rRNA各一分各一分子。子。核糖体的结构核糖体的结构34 核糖体可分为翻译区域核糖体可分为翻译区域（translational domaintranslational domain）和 逐 出 区 域（和 逐 出 区 域（e x i t e x i t domaindomain），有），有A A、P P
13、、肽链、肽链转移酶活性位点、转移酶活性位点、EF-TuEF-Tu、EF-GEF-G、5 S rRNA5 S rRNA、mRNAmRNA和和逐出（逐出（E E位）等活性位点。位）等活性位点。翻译区域占翻译区域占2/32/3，逐出区域，逐出区域占占1/31/3。核糖体上活性位点之间有着密切的联系，一个位核糖体上活性位点之间有着密切的联系，一个位点的变化可影响其他位点的功能。点的变化可影响其他位点的功能。A A位和位和P P位要同时结合位要同时结合tRNAtRNA，每个，每个tRNAtRNA结合一个密结合一个密码子，所以二者相距很近。只有码子，所以二者相距很近。只有P P位结合了肽酰位结合了肽酰-t
14、RNAtRNA后，氨基酰后，氨基酰-tRNA-tRNA才能与才能与A A位结合，可见位结合，可见P P位位影响影响A A位的活性。位的活性。多核糖体：由一个多核糖体：由一个mRNAmRNA分子与一定数目分子与一定数目的单个核糖体结合而成，形成念珠状。的单个核糖体结合而成，形成念珠状。每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，所以在多核糖体上可同时进行多条多肽所以在多核糖体上可同时进行多条多肽链的合成，这就提高了翻译效率。链的合成，这就提高了翻译效率。（四）活化的氨基酸（四）活化的氨基酸 氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额外的能
15、量。外的能量。活化形式即氨酰活化形式即氨酰tRNAtRNA 由氨酰由氨酰 tRNAtRNA合成酶催化进行合成酶催化进行（五）氨酰（五）氨酰tRNAtRNA合成酶合成酶(amino acyl tRNA synthefeases)(amino acyl tRNA synthefeases)氨酰氨酰tRNAtRNA合成酶有三个结合位点合成酶有三个结合位点,为氨基酸结合位为氨基酸结合位点、点、ATPATP结合位点和结合位点和tRNAtRNA结合位点。结合位点。高度专一性高度专一性每种氨基酸都有一个专一的酶。每种氨基酸都有一个专一的酶。不同酶分子间几乎不同酶分子间几乎没有同源性，可能起源于进化的早期。没
16、有同源性，可能起源于进化的早期。只作用于只作用于L L氨基酸氨基酸 这种严格的专一性大大减少了多肽合成中的差错。这种严格的专一性大大减少了多肽合成中的差错。起始（起始（initiationinitiation）延伸（延伸（elongationelongation）终止（终止（terminationtermination）翻译的速度很快，在37为15个氨基酸/秒。一个300个氨基酸组成的蛋白质分子只需20秒就能完成。原核生物的翻译过程原核生物的翻译过程蛋白质生物合成初始产物的后加工蛋白质生物合成初始产物的后加工一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质1 1、分子伴
17、侣：、分子伴侣：HSPHSP，伴侣素，伴侣素2 2、蛋白二硫键异构酶、蛋白二硫键异构酶3 3、肽、肽-脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶二、一级结构的修饰二、一级结构的修饰 1 1、肽链、肽链N N端端修饰：端端修饰：fMetfMet的去除。的去除。2 2、个别氨基酸的共价修饰：、个别氨基酸的共价修饰：乙酰化乙酰化 主要发生在主要发生在N N末端末端氨基和赖氨酸的氨基和赖氨酸的氨基上；氨基上；甲基化甲基化 发生在发生在氨基、氨基、氨基、精氨酸的胍基和氨基、精氨酸的胍基和C C末端末端的的羧基和侧链的羧基上；羧基和侧链的羧基上；二硫键的形成二硫键的形成通过两个半胱氨酸的巯基氧化形成通过两个半胱氨酸
18、的巯基氧化形成 糖基化、磷酸化、泛酸等糖基化、磷酸化、泛酸等 多肽链的水解修饰：无活性蛋白质前体经水解为有活性多肽链的水解修饰：无活性蛋白质前体经水解为有活性蛋白质蛋白质三、空间结构的修饰三、空间结构的修饰亚基聚合辅基连接疏水脂链的共价连接 无论原核生物还是真核生物无论原核生物还是真核生物,蛋白质除游离于胞浆内发挥蛋白质除游离于胞浆内发挥作用外作用外,还有一部分要分泌到细胞外和定位于膜系统中起还有一部分要分泌到细胞外和定位于膜系统中起作用。作用。在绝大多数细菌的越膜蛋白中在绝大多数细菌的越膜蛋白中,N,N端都有一长为端都有一长为15153030个氨个氨基酸的信号肽。信号肽的前半段富含精氨酸和赖
19、氨酸基酸的信号肽。信号肽的前半段富含精氨酸和赖氨酸,带带正电荷正电荷;后半段以疏水性氨基酸为主。后半段以疏水性氨基酸为主。蛋白质不但要决定是否越膜蛋白质不但要决定是否越膜,还要决定要越膜的种类。在还要决定要越膜的种类。在越膜过程中越膜过程中,有时要在翻译的同时发生信号序列的切除。有时要在翻译的同时发生信号序列的切除。信号肽的切除信号肽的切除蛋白质生物合成的干扰和抑制蛋白质生物合成的干扰和抑制一、抗生素类抗生素作用点作用原理应用四环素族（金霉素 新霉素、土霉素）链霉素、卡那霉素、新霉素氯霉素、林可霉素红霉素梭链孢酸 放线菌酮嘌呤霉素原核核蛋白体小亚基原核核蛋白体小亚基原核核蛋白体大亚基原核核蛋白
20、体大亚基原核核蛋白体大亚基真核核蛋白体大亚基真核、原核核蛋白体 抑制氨基酰-tRNA与小亚基结合改变构象引起读码错误、抑制起始抑制转肽酶、阻断延长抑制转肽酶、妨碍转位与EFG-GTP结合，抑制肽链延长抑制转肽酶、阻断延长氨基酰-tRNA类似物，进位后引起未成熟肽链脱落抗菌药抗菌药抗菌药抗菌药抗菌药医学研究抗肿瘤药二、其他干扰蛋白质生物合成的物质二、其他干扰蛋白质生物合成的物质（一）毒素（一）毒素(toxin)-真核生物真核生物（二）干扰素（二）干扰素(interferon)-抗病毒抗病毒原核与真核生物原核与真核生物RNARNA翻译的异同翻译的异同 原核生物原核生物 真核生物真核生物 转录和翻译
21、在同一地点转录和翻译在同一地点 翻译在细胞质，转录在翻译在细胞质，转录在细细 胞核胞核核糖体核糖体 整体整体 70S 80S 亚基亚基 30S和和50S 40S和和60SmRNA 无无5帽子，无帽子，无poly（A）尾）尾 有有5帽子和帽子和poly（A）尾尾 多顺反子多顺反子 单顺反子单顺反子起始密码起始密码 AUG，GUG AUG起始起始tRNA载体载体 甲酰甲硫氨酸甲酰甲硫氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸起始位点起始位点 SD序列序列 相关序列相关序列起始因子起始因子 三个三个IF 约有约有10个个eIF延伸因子延伸因子 EF-Ts/Tu/G EF-1/1 /2释放因子释放因子 三个三个RF 一个
22、一个RF翻译水平的调控翻译水平的调控一、反义一、反义RNARNA的调控作用的调控作用 19831983年，年，MizunoMizuno和和SimonSimon几乎同时发现了反几乎同时发现了反义义RNARNA对于基因表达的调控作用，从而揭示了一种新对于基因表达的调控作用，从而揭示了一种新的基因表达调控的机制。反义的基因表达调控的机制。反义RNARNA通过互补的碱基与通过互补的碱基与特定的特定的mRNAmRNA结合，结合位点通常是结合，结合位点通常是mRNAmRNA上的上的S-DS-D序列，序列，起始密码子起始密码子AUGAUG和部分和部分N N端的密码子，从而抑制端的密码子，从而抑制mRNAmR
23、NA的的翻译。人们称这类翻译。人们称这类RNARNA为干扰为干扰mRNAmRNA的互补的互补RNA,RNA,简称简称micRNA(mRNA-interfering complementary RNA)micRNA(mRNA-interfering complementary RNA)。二、二、mRNAmRNA本身的二级结构影响翻译的进行本身的二级结构影响翻译的进行三、三、mRNAmRNA的的 寿命对基因表达的影响寿命对基因表达的影响 短 2-3分钟，能够迅速适应环境，但有大的差异 四、蛋白质合成的自体调控四、蛋白质合成的自体调控有些蛋白质还能直接控制自身有些蛋白质还能直接控制自身mRNAmRN
24、A的可翻译性。的可翻译性。释放因子释放因子RF2RF2合成的自体调控合成的自体调控5GUUCUUAGGGGGUAUCUUUGACUACGAC325 26终止密码子终止密码子UGAUGA能被能被RF2RF2识别而实现翻译的终止；在缺少识别而实现翻译的终止；在缺少RF2RF2时，能通过移框时，能通过移框作用连续翻译后面作用连续翻译后面315315个氨基酸，产生完整的个氨基酸，产生完整的RF2RF2蛋白分子。蛋白分子。20102010诺贝尔生理或医学奖诺贝尔生理或医学奖罗伯特罗伯特爱德华兹：试管婴儿之父爱德华兹：试管婴儿之父还有什么不能在体外完成的？原核细胞体外翻译系统原核细胞体外翻译系统 利用大肠
25、秆菌进行外源性目的蛋白的表达利用大肠秆菌进行外源性目的蛋白的表达是一种获得大量重组蛋白的有效系统。但是一种获得大量重组蛋白的有效系统。但由于大肠秆菌中存在一些宿主自身编码的由于大肠秆菌中存在一些宿主自身编码的抑制物，因此有些外源蛋白在大肠秆菌中抑制物，因此有些外源蛋白在大肠秆菌中不能进行有效的高水平表达。为了解决这不能进行有效的高水平表达。为了解决这个问题，大肠秆菌提取物的体外翻译系统个问题，大肠秆菌提取物的体外翻译系统应运而生。应运而生。适用于对环状适用于对环状DNADNA进行体外翻译的大肠秆菌进行体外翻译的大肠秆菌S30S30提提取物系统取物系统 适用于对线状适用于对线状DNADNA进行体
26、外翻译的大肠秆菌进行体外翻译的大肠秆菌S30S30提提取物系统取物系统 适用于对环状适用于对环状DNADNA进行体外翻译的大肠秆菌进行体外翻译的大肠秆菌T7 S30T7 S30提取物系统提取物系统反应组分反应组分 mRNAmRNA 氨基酸氨基酸 S30S30反应液反应液 反应温度：反应温度：3737C C1-21-2小时。小时。真核细胞体外翻译系统真核细胞体外翻译系统 真核细胞体外翻译系统：真核细胞体外翻译系统：网织红细胞裂解液系统；网织红细胞裂解液系统；麦胚提取物系统；非洲麦胚提取物系统；非洲爪蟾卵母细胞体外翻译爪蟾卵母细胞体外翻译系统系统融合蛋白在分子生物学中的应用融合蛋白在分子生物学中的
27、应用 GFPGFP表达载体的构建及应用：表达载体的构建及应用：日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享2008年诺贝尔化学奖。标签蛋白 生物活性蛋白质：蛋白质药物 GFPGFP的应用的应用Protein AGFPRFP,YFP,CFP,His,MycGFP的应用应用pEGFP-N1THAP11mTHAP11XFP的应用的应用(YFP,RFP,CFP)基于蛋白质调控的技术方法基于蛋白质调控的技术方法原核表达载体原核表达载体特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号 启动子：
28、trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列一、基因表达载体一、基因表达载体优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性 融合蛋白表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编码。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后
29、才有活性很难表达大量的可溶性蛋白真核表达体系 转染方法 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染；人造膜 显微注射 筛选标志 Neor G418 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组病毒载体 逆转录病毒是一类正链RNA病毒，分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env编码的糖蛋白，能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效进入宿主细胞内；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合进宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达；成熟的病毒颗粒以芽生的方式进入细胞培养液上清液中，易于和
30、宿主细胞分离。HIV病毒简介病毒简介HIV21 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9200bp，含有gag、pol、env 3 个结构基因以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu 6 个调节基因。在病毒基因组的5端和3端各有相同的一段核苷酸序列，称为长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)。gag基因基因编码p55 的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)pol 基因基因编码病毒复制所需的酶类，包括逆转录酶，RNAse H，整合酶env 基因基因编码g
31、p120 和gp41 两种包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性tat 基因基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子，与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录rev 基因基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运，并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量nef 基因基因编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用vif 基因基因编码产物与病毒体的感染性有关vpu基因基因产物与病毒的装配、成熟和释放有关vpr 基因基因第三代慢病毒第三代慢病毒在第二代慢病毒基础上将gag/pol 和rev 编码序列隔离，分散在不同的质粒上，并将tat基因敲除，由四质
32、粒来代替原有的三质粒包装系统：质粒1:携带了gag/pol 编码序列及RRE 质粒2包含了编码rev 的序列 质粒3是载体质粒 质粒4表达VSV2G基因表达载体表达载体9380 bpNheISphIPstI(6462)XbaIAor51HISalI(6484)wPREdR3RU5SV40polyA oriRpUC19phage F1 originpUC19CMV IE-I promRU5PBS SL123SL4 mgagRREcPPTPolyAsimian Mason-Pfizer type D retrovirus CTEeGFPminhCMVhPGKEcoRV(5919)ClaI(4581
33、)ScaI(439)pBPLVKpnI(8055)AvrII(8701)gag/env：packaging signalRNARNA干扰技术干扰技术19951995年，康乃尔大学的年，康乃尔大学的Su GuoSu Guo博士在试图阻断秀博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（丽新小杆线虫（C.elegansC.elegans）中的）中的par-1par-1基因时，基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNARNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义对照实验中给线虫注射正义RNARNA
34、（sense RNAsense RNA）以）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了都同样地切断了par-1par-1基因的表达途径。这是与传基因的表达途径。这是与传统上对反义统上对反义RNARNA技术的解释正好相反的。该研究小技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。组一直没能给这个意外以合理解释。RNARNA干扰干扰 19981998年年2 2月，华盛顿卡耐基研究院的月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew FireAndrew Fire和马萨诸塞和马萨诸塞大学医学院的大学医学院的Craig MelloCraig
35、Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，大量艰苦的工作，他们证实，Su GuoSu Guo博士遇到的正义博士遇到的正义RNARNA抑抑制基因表达的现象，以及过去的反义制基因表达的现象，以及过去的反义RNARNA技术对基因表达的技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得阻断，都是由于体外转录所得RNARNA中污染了微量双链中污染了微量双链RNARNA而引而引起。当他们将体外转录得到的单链起。当他们将体外转录得到的单链RNARNA纯化后注射线虫时发纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过
36、纯化的双链RNARNA却却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为这一现象称为RNARNA干扰（干扰（RNA interference,RNA interference,简称简称RNAiRNAi）。）。RNAi指在细胞中引入双链指在细胞中引入双链RNARNA分子从而导致具有序分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默的现象。列同源性的基因产生特异性基因沉默的现象。RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达在真核细胞中都发现在真核细胞中都发现R
37、NAiRNAi现象的存在。现象的存在。RNAiRNAi作用机制作用机制 当当dsRNAdsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNAdsRNA特异的核酸内切酶识别，特异的核酸内切酶识别，切割成切割成21-2321-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNAdsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNAmRNA；识别；识别之后，之后，mRNAmRNA与与dsRNAdsRNA的有义链发生链互换，原先的有义链发生链互换，原先dsRNAdsRNA中的有中的有义链被义链被mRNAmRNA代替，从酶代
38、替，从酶-dsRNA-dsRNA复合物中释放出来，而复合物中释放出来，而mRNAmRNA则则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNAmRNA进行切进行切割，这样又产生了割，这样又产生了21-2321-23核苷酸长的核苷酸长的dsRNAdsRNA小片段，与核酸酶小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的形成复合物，继续对目的mRNAmRNA进行切割，从而使目的基因沉进行切割，从而使目的基因沉默，产生默，产生RNAiRNAi现象。现象。siRNA siRNA 设计设计在制备在制备siRNA siRNA 前都需要单独设计前都需要单独设计siRNAsiR
39、NA序列。研究序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAssiRNAs是是21-2321-23个个碱基大小、碱基大小、3 3端有两个突出碱基的双链端有两个突出碱基的双链RNARNA；而对；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNAdsRNA。siRNAsiRNA的的序列专一性要求非常严谨，与靶序列专一性要求非常严谨，与靶mRNAmRNA之间一个碱基之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。错配都会显著削弱基因沉默的效果。选择选择siRNAsiRNA靶位点靶位点 ;序列同源性分析序列同源性分析;设计阴性对照设计阴性对照网上提供免
40、费的网上提供免费的siRNAsiRNA设计工具设计工具http:/ http:/ http:/ vector分析分析RNAiRNAi的效果的效果 RNAiRNAi分子水平的检测主要通过分子水平的检测主要通过mRNAmRNA和蛋白两个方面和蛋白两个方面进行检测。对于进行检测。对于mRNAmRNA，可以采用，可以采用 RT-PCRRT-PCR，定量，定量PCRPCR，或或NorthernNorthern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过对蛋白水平进行检
41、测，可通过WesternWestern杂交，杂交，ELISAELISA，免疫荧光等。当然免疫荧光等。当然RNAiRNAi最大以及最终的效果是细胞最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化变化 编码区编码区RNAiRNAi技术技术以基因编码区为靶序列的编码区以基因编码区为靶序列的编码区RNAiRNAi技术已用于线虫功能技术已用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些
42、方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这种早期的这种早期的RNAiRNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成功能，但由于细胞分裂造成dsRNAdsRNA的稀释，使得这种方法在的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。研究成体的基因功能时有一定的局限性。RNAiRNAi技术在功能基因组中的应用技术在功能基因组中的应用 可诱导的可诱导的RNAiRNAi：为弥补早期：为弥补早期RNAiRNAi技术的上述不足，技术的上述不足，Tave
43、rnarakisTavernarakis等对等对RNAiRNAi技术进行了改进，将目的基因的技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNAdsRNA，从而产生，从而产生RNAiRNAi，使目的基因沉默。优点：可以遗传给后代，有利，使目的基因沉默。优点：可以遗传给后代，有利于突变的分析；其次于突变的分析；其次dsRNAdsRNA可以被诱导产生，可以被诱
44、导产生，RNAiRNAi能够在能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能；另外，当用细胞特异性启动子育晚期的功能成为可能；另外，当用细胞特异性启动子控制控制dsRNAdsRNA的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。功能。启动子区启动子区RNAiRNAiM.F.MettM.F.Mett等证明含有启动子区的等证明含有启动子区的dsRNAdsRNA在植物体内同样被切在植物体内同样被切割成割成21-2321-23核苷酸长的片段，这种核苷酸长的片段，这种dsRNAdsRNA可使
45、内源相应的可使内源相应的DNADNA序序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区RNAiRNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区序列通常比编码区变化大，采用启动子区RNAiRNAi技术有望将多基技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区RNAiRNAi技术和技术和启动
46、子区启动子区RNAiRNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族各成员技术的信息即可更全面地了解多基因家族各成员的功能。的功能。比反义比反义RNARNA技术更有效，更容易产生功能丧失或降技术更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行。官中有选择地进行。与传统的基因敲除技术相比，投入少，周期短，与传统的基因敲除技术相比，投入少，周期短，操作简单。成功用于构建转基因动物模型，标志操作简单。成功用于构建转基因动物模型，标志着着RN
47、AiRNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。将成为研究基因功能不可或缺的工具。基因治疗的新途径。基因治疗的新途径。蛋白相互作用的研究方法蛋白相互作用的研究方法酵母双杂交酵母双杂交免疫共沉淀免疫共沉淀GST-pull downGST-pull down细胞共定位细胞共定位BNBN温和胶技术蛋白复合体温和胶技术蛋白复合体基于蛋白质相互作用的研究方法基于蛋白质相互作用的研究方法酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活
48、结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。酵母双杂交酵母双杂交 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因造的、含报道基因(reporter gene)(reporter gene
49、)的重组质粒的宿主细的重组质粒的宿主细胞。胞。最常用的是酵母细胞，最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点交系统具有许多优点:1 1 易于转化、便于回收扩增质粒。易于转化、便于回收扩增质粒。2 2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3 3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。酵母双杂交 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷贝和强启动子的表
50、高度敏感性。主要是由于：采用高拷贝和强启动子的表达载体使融合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓达载体使融合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结度条件下进行。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启后者又与启动子动子DNADNA结合，结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。酵母表型，定。酵母表型，X-GalX-Gal及及HIS3HIS3蛋白表达等检测方法均很蛋白表达等检测方法均很敏感。敏感。酵母双杂交 利用酵母双杂交发现新的蛋
