1、实验三实验三重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌#技能教育实实 验验 目目 的的 p 学习将重组质粒学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法导入大肠杆菌的方法p 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法p 为下一步重组体筛选做准备为下一步重组体筛选做准备#技能教育实实 验验 原原 理理 遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平肠杆菌细胞，使
2、携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。这个过程就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、殊方法（电击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进分子进入的细胞即感受态
3、细胞入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。#技能教育 转化转化(Transformation)是将外源是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。基本实验技术。0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在是一种低渗溶液，在0低温处理大肠杆菌细低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如（如42 ）下，细胞可吸收外源
4、）下，细胞可吸收外源DNA。为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。则不能再这种培养基上生长。#技能教育Ampr：氨苄西林抗性基因：氨苄西林抗性基因 内酰胺酶内酰胺酶多克隆位点（多克
5、隆位点（MCS）：外源）：外源DNA片段的插入位点片段的插入位点Amps菌株菌株Ampr涂布于含涂布于含Amp的培养基上，可以生长。的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落次日可见白色菌落-转化子。转化子。培养基上含有培养基上含有X-Gal和和IPTG时，可使用蓝白时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。的重组的转化子。pET32apET32a#技能教育结构的三大要素：结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）复制起始位点种类：种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表达载体等#技能教育#技能教育pET-32a VectorThe pE
6、T System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E.coli.#技能教育pET-32 cloning/expression region#技能教育Vector(pET-32a)Gene fragment(SmPR10)pET32a-SmPR10#技能教育材料、设备及试剂材料、设备及试剂 材料材料 E.coli DH5菌株菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细胞转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不
7、含限制性内切酶和甲一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳分子进入体内并稳定地遗传给后代。）定地遗传给后代。）pET32a-SmPR10质粒质粒DNA（浓度：（浓度：2 ng/l):实验室自制实验室自制设备设备 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。#技能教育 试剂试剂 1、LB固体和液体培养基固体和液体培养基 LB培养基配方：（单
8、位培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨胰蛋白胨 10 酵母提取物酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（琼脂粉（1.5%）15g （注：（注：LB液体培养基不加琼脂粉）液体培养基不加琼脂粉）按配方称量药品按配方称量药品,加入一定量的加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至定容至1000ml,用用NaOH调节调节pH至至7.0。121湿热高压灭菌湿热高压灭菌20分钟，待冷却至分钟，待冷却至60左右左右,在超净工作台中加在超净工作台中加入一定量的入一定量的Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为100g/ml,摇匀
9、后用培养皿铺板。摇匀后用培养皿铺板。#技能教育2、Amp母液：母液：称取氨苄西林称取氨苄西林100mg溶于溶于1mlddH2O中，中，0.22m滤器滤器过过滤除菌滤除菌，用，用1.5ml离心管分装后储存于离心管分装后储存于-20冰箱冰箱.3、0.1mol/L CaCl2 溶液溶液:称称0.56gCaCl2(无水分析纯无水分析纯),溶于溶于50ml重蒸水中重蒸水中,定容至定容至100ml,用用0.22m滤器过滤除菌或高压灭菌。滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于管分装于4冰箱储存冰箱储存.4、pET32a-SmPR10质粒：实验室自制质粒：实验室自制#技能教育操操 作作 步步 骤骤（一）（一）受
10、体菌的培养受体菌的培养 1、取、取-70或或-20贮存的大肠杆菌贮存的大肠杆菌DH5菌种，菌种，在在LB培养液中培养过夜，培养液中培养过夜，进行活化进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布平板上涂布,于于37培养箱中培养培养箱中培养24h；从；从LB平板上挑取单菌落平板上挑取单菌落,接种于接种于3-5ml LB液液体培养基中体培养基中,37下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生长后期。直至对数生长后期。3、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于LB液体培养基中液体培养基中
11、,37振荡培振荡培养养2-3小时至小时至OD600 0.5左右左右(生长对数期）。生长对数期）。（注：这一步非常关键。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的培养过度的菌液含有较多的“老老”细胞，制备成感受态细胞后其接受细胞，制备成感受态细胞后其接受外援外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）能力较低，从而导致转化率降低。）#技能教育（二）、（二）、感受态细胞的制备感受态细胞的制备 (CaCl2 法法)1、将菌液转入、将菌液转入1.5ml离心管中离心管中,冰上冰上放置放置10分钟分钟,然后于然后于4、4000rpm离心离心10分钟。分钟。2、弃去上清、弃去上清,用用预冷预冷的的0.1m
12、ol/L的的CaCl2 溶液溶液1ml轻轻悬轻轻悬浮细胞浮细胞,冰上放置冰上放置10分钟后分钟后,4、4000rpm离心离心10分钟。分钟。3、弃去上清、弃去上清,加入加入0.1ml预冷预冷的的0.1mol/L的的CaCl2 溶液溶液,轻轻轻悬浮细胞。每份轻悬浮细胞。每份100l（注意悬液密度要均匀）（注意悬液密度要均匀）,冰冰上放置备用。上放置备用。4、暂时不用的感受态细胞可置于、暂时不用的感受态细胞可置于-80保存。保存。注：注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！#技能教育（三）（三）重组质粒重组质粒DNADNA的转化的转化 1.质粒和感受态
13、细胞混和：在质粒和感受态细胞混和：在100l感受态细胞悬液中加感受态细胞悬液中加入入5l重组质粒重组质粒DNA（pET32a-SmPR10），轻轻混匀），轻轻混匀后冰上放置后冰上放置30分钟。分钟。2.热击：热击：42水浴中热击水浴中热击60秒（秒（注：精确计算时间，热注：精确计算时间，热击过长将对细胞造成伤害击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷热击后马上置于冰上冷2-5分钟。分钟。3.复苏：向每管中加入复苏：向每管中加入800l LB液体培养基液体培养基(注：不含注：不含Amp),混匀后在混匀后在37150rpm轻摇培养轻摇培养1小时小时，使细菌恢使细菌恢复正常生长状态复正常生长状
14、态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。思考：思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为什么复苏时用的什么复苏时用的LB培养液不加培养液不加Amp？#技能教育（四）涂布平板筛选转化质粒（四）涂布平板筛选转化质粒 1.将管中培养液摇匀后取将管中培养液摇匀后取100l 均匀涂布于含均匀涂布于含Amp的筛选的筛选平板上。平板上。（注：将培养液摇匀后涂布。）（注：将培养液摇匀后涂布。）2.正面向上放置半小时正面向上放置半小时,待
15、菌液完全被培养基吸收后待菌液完全被培养基吸收后倒置倒置培培养皿养皿，37温箱中培养过夜温箱中培养过夜，次日观察实验结果，次日观察实验结果。#技能教育预期实验结果预期实验结果感受态细胞感受态细胞+重组质粒重组质粒0.1MCaCl2+重组质粒重组质粒感受态细胞感受态细胞+无菌水无菌水#技能教育实验报告 思考题思考题(1).根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2).如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？你将如何解释这种现象？#技能教育实验中要考虑的重要因素实验中要
16、考虑的重要因素 为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次继代或储于不要用经过多次继代或储于的培的培养菌，最好从养菌，最好从-70或或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的好，可通过监测培养液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有
17、所不同不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。#技能教育 2.质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度:用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比的浓度在一定范围内成正比,但但当加入的外源当加入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。10ng的的cccDNA即可使即可使100l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶溶液的体积不应超过
18、感受态细胞体积的液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3.试剂的质量试剂的质量:所用的试剂，如所用的试剂，如CaCl2 等均需是高纯度的等均需是高纯度的(GR.或或AR.),并并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行下进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip头等最好是新的头等最好是新的,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污所污染染,否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入,为以后的筛选、鉴定带为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。来不必要的麻烦。#技能教育
