1、【实验目的实验目的】 1 1熟悉层析技术概念熟悉层析技术概念，分类分类 2 2掌握凝胶通透层析基本原理掌握凝胶通透层析基本原理 3 3掌握凝胶通透层析法的操作掌握凝胶通透层析法的操作 4 4熟悉物质层析柱中洗脱行为与分配系数熟悉物质层析柱中洗脱行为与分配系数（Kd） 的关系的关系 凝胶层析凝胶层析（分子筛层析法）（分子筛层析法） 分离物质分离物质 葡聚糖凝胶柱层析分离物质葡聚糖凝胶柱层析分离物质 本试验采用本试验采用葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex G 50Sephadex G 50层析层析 方法，以方法，以蓝葡聚糖蓝葡聚糖 20002000（分子量（分子量2000 kD)2000 kD)
2、、DNFPDNFP- -甘甘 氨酸（分子量氨酸（分子量0.5 kD)0.5 kD)的混合物通过交联葡聚糖的混合物通过交联葡聚糖G G- -5050 的层析柱，以的层析柱，以蒸馏水蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。为洗脱溶剂进行洗脱。 凝胶层析凝胶层析原理：原理： 凝胶层析法是按混合物各组分凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小分子量大小不同随不同随 流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一当吸收一 定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质定量溶液后溶涨成柔软
3、、富有弹性、不带电荷、不与溶质 相互作用的惰性物质，相互作用的惰性物质，凝胶凝胶层析以其为固定相。层析时，层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的直径大于凝胶网孔的大分子物质大分子物质不能进入凝胶内部，只不能进入凝胶内部，只 能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、 流速快，首先流出层析柱；而流速快，首先流出层析柱；而小分子物质小分子物质直径小于凝胶直径小于凝胶 网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定 时间时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目层析，分
4、子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目 的的。 凝胶层析法分离物质凝胶层析法分离物质 凝胶柱层析分离凝胶柱层析分离 数学模型 Vo Vi Ve ViVi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水） VoVo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水） VeVe洗脱体积洗脱体积 洗脱总体积洗脱总体积Ve Ve = = Vi Vi + +VoVo 在洗脱液的洗脱下，混合物中在洗脱液的洗脱下，混合物中分子分子 量最大量最大的物质的物质最先出柱最先出柱，分子量最分子量最 小小的物质的物质最后出柱最后出柱；介乎中间的物；介乎中间的物 质，则分子量愈大洗出愈快，分子质，则分子量愈大洗出愈快，分子 量愈小洗出愈慢。这样，不同的
5、物量愈小洗出愈慢。这样，不同的物 质就被分离。质就被分离。 混合物中各物质在凝胶柱内层析时的混合物中各物质在凝胶柱内层析时的 洗脱行为和各自的洗脱行为和各自的分配系数分配系数Kd有关。有关。 Kd Kd 分配系数：精确衡量混合物分配系数：精确衡量混合物 中某一待分离成分在凝胶柱内的洗中某一待分离成分在凝胶柱内的洗 脱行为，反映物质分子进入凝胶颗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗 粒的程度，是溶质分子大小的一个粒的程度，是溶质分子大小的一个 函数函数 VeVe洗脱体积：分离物被洗脱时所洗脱体积：分离物被洗脱时所 用的洗脱液体积用的洗脱液体积 Ve Ve = = Vo Vo + + KdKdViVi
6、洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标， 各物质颜色度为纵坐标作图各物质颜色度为纵坐标作图 在洗脱过程中，被洗脱成分的洗脱行为在洗脱过程中，被洗脱成分的洗脱行为 可以有三种可能的情况：可以有三种可能的情况： (1)Ve=Vo(1)Ve=Vo，表示被洗脱的某成分流经层析柱全程所需，表示被洗脱的某成分流经层析柱全程所需 的洗脱液体积和凝胶颗粒间隙的总体积相等。即该成的洗脱液体积和凝胶颗粒间隙的总体积相等。即该成 分的分子分的分子全部被排阻全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入在凝胶颗粒的间隙中，而未进入 凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，被凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，被最先洗
7、脱最先洗脱出来。出来。 即该成分的即该成分的KdKd0 0。 ( (2)Vi2)ViVeVe- -VoVo，表示某成分被洗脱出来所需洗脱液的，表示某成分被洗脱出来所需洗脱液的 总体积和凝胶颗粒外部孔隙的总体积之差，等于凝胶总体积和凝胶颗粒外部孔隙的总体积之差，等于凝胶 颗粒内部的总体积。即该成分颗粒内部的总体积。即该成分不被排阻而被滞留不被排阻而被滞留，可，可 完全进入凝胶颗粒内部。因而洗脱速度最慢，被完全进入凝胶颗粒内部。因而洗脱速度最慢，被最后最后 洗脱出来洗脱出来。即该成分的。即该成分的Kd=lKd=l。 ( (3)Kd3)Kd值介于值介于0101之间，之间，在此范围内，物质的洗脱速度在
8、此范围内，物质的洗脱速度 随其随其KdKd值的增加而降低，值的增加而降低，KdKd值越大，被排阻的程度越值越大，被排阻的程度越 小，即被滞留的程度越大，洗脱速度越慢；反之，小，即被滞留的程度越大，洗脱速度越慢；反之，KdKd 值越小，被排阻在外的程度越大，洗脱速度越快。值越小，被排阻在外的程度越大，洗脱速度越快。 （1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，Ve Ve = =VoVo，Kd Kd =0=0 （2 2）中等分子，）中等分子，Ve Ve = =Vo Vo + + KdKdViVi，00Kd Kd 11 （3 3）完全渗透的小分子，）完全渗透的小分子，Ve Ve =
9、=VoVo+ +ViVi， Kd Kd =1=1 Vea=Vo Vi Veb Vec=Vo+Vi 原理原理 本实验将蓝葡聚糖本实验将蓝葡聚糖2000(2000(分子量分子量2000KD2000KD) )和和DNFPDNFP- - 甘氨酸甘氨酸 ( (分子量分子量0.5KD0.5KD) )的混合物通过交联葡聚糖的混合物通过交联葡聚糖 凝胶凝胶G G- -5050的层析柱以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。的层析柱以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。 蓝葡聚糖蓝葡聚糖20002000分子量最大全部被排阻在凝胶颗粒分子量最大全部被排阻在凝胶颗粒 的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部、因而洗脱速的间隙中，而未进入凝胶颗粒内
10、部、因而洗脱速 度最快，度最快，最先流出柱最先流出柱，其，其VeVeVoVo即即KdKd0 0。 DNFPDNFP- -甘氨酸甘氨酸，分子量最小不被排阻而可完全进，分子量最小不被排阻而可完全进 入凝胶颗粒内部洗脱速度最慢，最后流出柱，其入凝胶颗粒内部洗脱速度最慢，最后流出柱，其 VeVeVi+VoVi+Vo即即KdKd1 1。 可以直接从蓝、黄两种不同颜色直接观察到两种可以直接从蓝、黄两种不同颜色直接观察到两种 物质分离的情况，并通过洗脱体积可以计算物质分离的情况，并通过洗脱体积可以计算ViVi、 VoVo和各自的和各自的KdKd。 Sephadex GSephadex G- -5050的准备
11、的准备 装柱（装柱（18cm18cm） 操作步骤：操作步骤： 1 1、层析柱保持垂直。、层析柱保持垂直。 2 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3 3、加入搅拌均匀的、加入搅拌均匀的SephadexGSephadexG- -5050悬液，调节流速悬液，调节流速1010滴滴/min/min， 使凝胶均匀沉降，不断补充，直至使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm18cm。 4 4、上留、上留1 1- -2mm2mm的水，关闭出口。的水，关闭出口。 注意：注意： 床面上要保持少许水，床面上要保持少许水，防止胶床露出液面防止胶床露出液面。 胶面不平胶面不平，用
12、玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。使表面平整。 加样与洗脱加样与洗脱 凝胶的再生凝胶的再生 1、加样：、加样：用滴管将约用滴管将约0.5ml样品加入柱床面，打开出口使样样品加入柱床面，打开出口使样 品溶液渗入凝胶。品溶液渗入凝胶。 2、洗脱与收集：、洗脱与收集：加入洗脱液，打开出口，保持流速加入洗脱液，打开出口，保持流速 15滴滴/min，收集洗脱液，每管收集，收集洗脱液，每管收集1ml （20 滴）滴） 。 3、绘制洗脱曲线：、绘制洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色度以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色度 为为 （- -，+ +，+，+）为纵坐标
13、（相对指示洗脱液内物）为纵坐标（相对指示洗脱液内物 质浓度的变化），作图，得到洗脱曲线。质浓度的变化），作图，得到洗脱曲线。 4 4、计算凝胶柱的、计算凝胶柱的 VoVo，ViVi和和KdKd值值。 不断加洗脱液，使样品全部流出，为下次实验做准备不断加洗脱液，使样品全部流出，为下次实验做准备 洗脱洗脱 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 上样上样 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G G- -5050， 柱高柱高18cm18cm 流速：每分钟流速：每分钟15滴左右滴左右 加入洗脱剂加入洗脱剂 收集收集 20滴换滴换 一支试管一支试管 . .收集收集 用用“- -”表示无现象，用表示无现象，用
14、“+ +”, , “+”, , “+”等表示颜色深浅等表示颜色深浅 回收凝胶回收凝胶 （1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，Ve Ve = =VoVo，Kd Kd =0=0 （2 2）中等分子，）中等分子，Ve Ve = =Vo Vo + +KdKdViVi，00Kd Kd 11 （3 3）完全渗透的小分子，）完全渗透的小分子，Ve Ve = =VoVo+ +ViVi， Kd Kd =1=1 实验记录实验记录 项目、日期、室温项目、日期、室温 数据记录数据记录 管号管号 1 - 4 5 颜色颜色 颜色度颜色度 6 实验报告实验报告 一、原理一、原理 二、操作二、操作 三、绘制洗脱曲线三、绘制洗脱曲线 四、结果四、结果 根据洗脱曲线计算蓝葡聚糖根据洗脱曲线计算蓝葡聚糖20002000和和 DNFPDNFP- -甘氨酸的甘氨酸的KdKd及及VoVo和和ViVi值。值。 五、讨论五、讨论
