1、水稻组织培养实验原理植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性,细胞全能性(toti potency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个完整机体的全套基因,在适宜的条件下,细胞具有形成一个新的个体的潜在能力。材料选取水稻种子(干种子或是湿种子均可)作为植物组织培养的外植体仪器电子天平、酸度计、微量移液器、电炉、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、超净工作台、剪刀、镊子、照度计、摇床、灭菌锅培养基母液配置大量元素母液配制:母液 A1(浓缩10倍):称取KNO3 19g、NH4NO3 16.5g、MgSO47H2O 3.7g、KH2PO4 1.7g,分别溶解后混合并定容至
2、1000ml,4保存备用;母液A2(浓缩10倍):称取CaCl22H2O 4.4g 定容至1000ml,4保存备用。微量元素母液配制(母液 B,浓缩 100 倍)称取 MnSO44H2O 2.23g、ZnSO47H2O 860mg、H3BO3 620mg、KI 83mg、NaMO42H2O 25mg、CuSO45H2O 2.5mg、CoCl6H2O 2.5mg,分别溶解并混合后定容至1000ml,4保存备用。铁盐母液配制(母液C 浓缩 100 倍):称取Na2-EDTA 3.77g、FeSO47H2O 2.78g、分别溶解并混合后定容至 1000ml,4保存备用。有机物质母液配制(母液 D,浓
3、缩50倍):称取甘氨酸 100mg、盐酸硫胺素20mg、盐酸吡哆素25mg、烟酸E25mg、肌醇 5000mg,分别溶解后混合并定容至 500ml,4保存备用。生长调节物质母液配制:为了操作方便,生长调节剂也可先配制成母液(药品在配制时若不溶于水,可用少量溶剂先溶解,如萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3),2,4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少量 95 酒精溶解,然后加水,若溶解不完全再加热;激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少量 1mol/L 的 HCL 中,叶酸需用少量稀氨水溶解称取 50mg 生长调节物质,溶解后,蒸馏水定容至 100ml,配制的母液每毫升则
4、含有生长调节物质0.5mg,4保存备用。MSMS固体培养基的配制及灭菌取 1000ml烧杯一只,加 500ml 水,然后加琼脂 10g,放至电炉子上(铺有石棉网)加热,边加热边搅拌至琼脂完全溶解(然后加蔗糖或白糖)30g 搅拌至其溶解;分别称取母液 A1 100ml、母液 A2 100ml、母液 B 10ml、母液C 10ml、母液D 10ml,到此烧杯中,搅拌均匀后用 0.5mol/L HCL 或 0.5mol/L 的 NaOH将培养基 PH 调至 5-8左右。不同培养阶段所需要的生长调节物质有很大的不同,因此不同阶段的培养基中要加入的生长调节物质是不一样的,如愈伤组织诱导培养基(MS+2,
5、4-D2.0mg/L)中2,4-D为每升2.0mg,而2,4-D母液的浓度为0.5mg/ml,则配制时要从其母液中吸取4mL。培养基配制好后,将其分装至150mL三角瓶中,每瓶40mL左右。用两层牛皮纸或硫酸纸将装好培养基的瓶口包裹住,用3个乳胶圈将瓶口封紧即可灭菌。培养基的灭菌条件为121,25min左右,灭菌时要将无菌操作的所需的备品灭全,包括剪刀、镊子、刀片、无菌水、报纸或滤纸等。外植体的表面消毒及接种选取饱满成熟的水稻种子,手工剥去颖壳,选取干净完整的颖果(在超净工作台内,先用 75酒精处理 30s,再用 0.1升汞处理 10min 或 2次氯酸钠溶液 15min,然后用无菌水冲洗 5
6、6次(用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干,然后用镊子夹取水稻种子轻轻放到愈伤组织诱导的培养基表面,每瓶 5 粒左右(每接 5 瓶左右,用75 酒精擦拭手和台面,进行消毒。不同培养阶段的培养基配方及培养条件:愈伤组织诱导和继代培养基为MS+2,4一D 2.0mg/L,培养条件为黑暗培养,温度控制在26(1);愈伤组织分化芽培养基为MS+6一BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L,光照强度为3000lux左右,光照时间为14h,温度控制在26(1);生根培养基为1/2MS+NAA 1.0 mg/L,光照强度为4000lux左右,光照时间为14h,温度控制在26(1)。实验结果根据上述培
7、养基配方所建立起来的水稻植株再生体系,愈伤组织诱导率)芽分化率及生根率均较高。水稻种子在诱导培养中培养10天左右,从水稻芽的基部长出淡黄色)呈细小颗粒状的愈伤组织(图 A)(水稻种子在诱导培养中所得到的愈伤组织)将愈伤组织转入分化芽的培养基后约7天,开始出现绿点并逐渐增多(图 B)(愈伤组织在分化芽的培养基中出现绿点)约5天后,原来出现绿点的愈伤组织整体颜色加深,并有部分芽已向小苗过渡(图 C)(由绿点所长成的丛生芽)约10天后,有丛生芽长成的幼苗逐渐增多,已有部分幼苗叶片展开(图 D)(由丛生芽长成的绿色幼苗)将幼苗的植株移至生根培养基中。3天左右即可生出根,然后逐渐增多,此时可以明显看见在
8、培养基中的生出的根(图 E)(绿色幼苗在分化根的培养基中生出的根)当水稻组培苗长高至 35cm时,即可进行炼苗,将三角瓶口打开放置室温下,一定避免强光直射,炼苗3天左右即可进行移栽(图 F)(炼苗及移栽成活的水稻再生植株)水稻炼苗方法有组培苗的培养瓶开口,培养基上覆水,约1 cm,置于温室3天左右,然后移栽到土中先将组培苗水培半个月,水稻营养液要求pH 5,待苗壮实后,移栽到土中。水稻种子做组织培养的优点操作简单,节省时间水稻外植体小,进行表面消毒后不易染菌,愈伤组织诱导率较高水稻种子保存容易且存活时间更长,可以随时取材实验参考文献1盛玉婷.2008.植物组织培养技术及应用进展(安徽农学通报,14(9):45472张志良,翟伟菁.2003.植物生理学实验指导(北京:高等教育出版社,3263273倪晋山,1985.植物生理学实验手册(薛应龙主编),上海科学技术出版社,63-64