1、1体内药物分析体内药物分析Biopharmaceutical Analysis;Biomedical Analysis。2乳酸左氧氟沙星（乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）片）用法用量：用法用量：口服口服。成人常用量：。成人常用量：1.支气管感染、肺部感染：一次支气管感染、肺部感染：一次2片，片，一日一日2次，或一次次，或一次1片，一日片，一日3次，次，疗程疗程7-14日。日。2.急性单纯性下尿路感染：一次急性单纯性下尿路感染：一次1片，片，一日一日2次，疗程次，疗程57日；复杂性尿日；复杂性尿路感染：一次路感染：一次2片，一日片，一日2次，或一次，或一次次1片，一日片，一日3次，疗程次，疗程10
2、14日。日。3.细菌性前列腺炎：一次细菌性前列腺炎：一次2片，一日片，一日2次，疗程次，疗程6周周。0.3-0.4g/日日0.2g/日日0.4g/日日NOCOOHFNNH3COHCH33抗菌药物的抗菌活性抗菌药物的抗菌活性药物抑制或者杀灭病原菌的能力药物抑制或者杀灭病原菌的能力最低抑菌浓度最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration）抑）抑制培养基内细菌生长的最低浓度。制培养基内细菌生长的最低浓度。MIC最低杀菌浓度最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration）杀灭培养基内杀灭培养基内99.9%的微生物。的微生物。MBC喹
3、诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓度的度的峰浓度峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。，即药物浓度越高，杀菌作用越强。浓度依赖性浓度依赖性时间依赖性时间依赖性杀菌活性与药物浓度杀菌活性与药物浓度维持在维持在MIC以上时以上时间间的长短有关。的长短有关。-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。内酰胺类、林可霉素类等抗生素。4乳酸左氧氟沙星（乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）片）用法用量：用法用量：口服口服。成人常用量：。成人常用量：1.支气管感染、肺部感染支气管感染、肺部感染：药物随着血液到各个组织药物随着血液到各个组织2.急性急性单纯性下尿路感染单纯
4、性下尿路感染：药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用3.细菌性前列腺炎：细菌性前列腺炎：药物随着血液药物随着血液到前列腺组织到前列腺组织0.3-0.4g/日日0.2g/日日0.4g/日日测定血液、尿液甚至测定血液、尿液甚至组织中的药物浓度组织中的药物浓度51.1体内药物分析的定义体内药物分析的定义体内样品（生物体液、器官或组织）中药物体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、定量分析。定量分析。体内样品体内样品确定分析对象确定分析对象药物、代谢产物、内源性生物活性物质药物、代谢产物、内
5、源性生物活性物质确定待分析物确定待分析物定性、定量分析定性、定量分析如何选择分析手段、建如何选择分析手段、建立方法并验证立方法并验证1.概述6体内体内药物药物分析分析原料药原料药纯度高纯度高干扰少干扰少容量分析为主容量分析为主制剂制剂主药一或多主药一或多辅料干扰多辅料干扰多仪器分析为主仪器分析为主体内药物体内药物成分复杂成分复杂干扰众多干扰众多浓度很低浓度很低高灵敏度高灵敏度高选择性的高选择性的方法方法71.21.2体内药物分析对象和待测物特点体内药物分析对象和待测物特点成分复杂、干扰众多成分复杂、干扰众多生物基质生物基质的干扰的干扰蛋白质、糖、脂肪、离子蛋白质、糖、脂肪、离子其他药物其他药物
6、的干扰的干扰卡马西平卡马西平治疗癫痫的有效血药浓治疗癫痫的有效血药浓度为度为38g/ml，潜在中毒浓度为，潜在中毒浓度为12 g/ml。病人可能之。病人可能之前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。代谢产物与原型药物代谢产物与原型药物互相干扰互相干扰抗抑郁药抗抑郁药米氮平米氮平N NNCH3N NNHN NNCH3HON NNCH3ODMR8-OHMN-O-MRT方法选择性方法选择性要高要高8体内药物分析对象和待测物特点体内药物分析对象和待测物特点采样量小，浓度很低采样量小，浓度很低常见的生物样品常见的生物样品采样量少，特定条件采集，不易重新获得采样
7、量少，特定条件采集，不易重新获得血浆：人血浆：人13ml；犬；犬15ml；大鼠；大鼠0.30.5ml浓度为浓度为ng/mlg/ml 数量级数量级p 血液（血浆、血清、全血）、尿液、血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品生物样品p 心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品生物样品方法灵敏度方法灵敏度要高要高91.3 体内药物分析方法的特点体内药物分析方法的特点对分析方法的要求高：对分析方法的要求高：满足灵敏度及专属性满足灵敏度及专属性的要求的要求样品需要经过前处理样品需要经过前处理，才能分析，才能分析分析工
8、作量大，方法验证要求严格分析工作量大，方法验证要求严格，测试数，测试数据处理和结果阐明较为复杂据处理和结果阐明较为复杂1.概述101.4体内药物分析的任务体内药物分析的任务定性分析定性分析药物代谢产物、内源性物质是什么药物代谢产物、内源性物质是什么定量分析定量分析血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度药物代谢与动力学药物代谢与动力学（drug metabolism and pharmacokinetics，DMPK）研究）研究新药研发新药研发治疗药物监测治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）临床应用临床应用内源性物质检测内源性物
9、质检测疾病标志物疾病标志物社会事件中的分析社会事件中的分析食品安全、法医毒物分食品安全、法医毒物分析等析等1.概述11体内药物分析的任务：体内药物分析的任务：DMPK药代动力学研究涉药代动力学研究涉及药物在体内的及药物在体内的吸吸收、分布、代谢与收、分布、代谢与排泄排泄等等动态过程动态过程，需要研究血需要研究血药药/组织组织浓度浓度时间曲线的时间曲线的变化，探讨药物分变化，探讨药物分布与药理作用的布与药理作用的关关系。系。1,2 Stability+Solubility3 Passive+Active Trans.4 Pgp efflux+CYP 3A45-Hepatic first pass
10、 effect12药物代谢与动力学药物代谢与动力学血药浓度血药浓度-时间曲线时间曲线尿药累积排泄曲线尿药累积排泄曲线生物等效性评价生物等效性评价绝对生物利用度绝对生物利用度相对生物利用度相对生物利用度代谢途径代谢途径代谢酶代谢酶13体内药物分析的任务：体内药物分析的任务：TDMTDM即测定血液中或其它体液中即测定血液中或其它体液中药物浓度药物浓度，观察临，观察临床床药物反应药物反应，考察药物，考察药物治疗效果治疗效果，必要时根据药动，必要时根据药动学原理调整给药方案。方向是学原理调整给药方案。方向是实现个体化给药，目实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果的为临床合理用药
11、服务，达到最佳的药物治疗效果。治疗范围治疗范围中毒范围中毒范围无效范围无效范围C最大耐受浓度最大耐受浓度最小最小有效浓度有效浓度14治疗药物监测治疗药物监测血药浓度血药浓度g/ml10202030304040药理及药理及毒性反应毒性反应有效血药浓度有效血药浓度眼球震颤眼球震颤运动失调运动失调精神异常精神异常抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应患者女性，患者女性，25岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥英钠英钠800mg并开始口服维持剂量并开始口服维持剂量250mg/d。测得苯
12、妥英钠的浓度为。测得苯妥英钠的浓度为 3.6 g/ml，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到400mg/d。患。患者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为10.9g/ml，医生拟打，医生拟打算再次增加剂量。算再次增加剂量。患者患者白蛋白为白蛋白为20g/L(正常范围是正常范围是3448g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英，于是建议检查患者游离苯妥英钠浓度。结果显示钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为游离苯妥英钠浓度为4.9 g/ml（游离药物治疗浓度范（游离药物治疗浓度范围围12 g/ml），判
13、定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。15体内药物分析的任务：内源性物质检测体内药物分析的任务：内源性物质检测体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。草酸、尿酸等。机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内内源内源性物质或疾病标志物性物质或疾病标志物的含量，疾病的辅助诊断或及的含量，疾病的辅助诊断或及早预防。早预防。药物（中药）代谢组学研究药物（中药）代谢组学研究16体内药物分析的中心任务体内药物分析的中心任务体内药物分析方法学研究体内药物
14、分析方法学研究生物样品生物样品预处理预处理方法方法分离分析分离分析实验条件的优化选择实验条件的优化选择考察体内分析方法的考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线灵敏度、专属性、准确度、线性范围等性范围等为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。准确、快速、简便的体内药物分析方法。172.1体内样品的种类与采集体内样品的种类与采集血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等汁、脑脊液等均匀生物样品均匀生物样品心、肝、脾、肺、肾、脑等心、肝、脾、
15、肺、肾、脑等非均匀生物样品非均匀生物样品样品选取原则样品选取原则（1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；（2）易于获得；）易于获得；（3）便于处理，适合于分析；）便于处理，适合于分析；（4）根据不同目的与要求进行选取。）根据不同目的与要求进行选取。2.体内样品的种类、采集与贮存18体内样品种类与采集体内样品种类与采集血液血液自然自然凝结凝结加抗加抗凝剂凝剂离心离心离心离心全血全血上层：上层：血清血清serum（比血浆少纤（比血浆少纤维蛋白原）（维蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）下层：血细胞（凝块）上层：上层：血浆血浆 plasma（50%）
16、下层：血细胞下层：血细胞血样血样BloodBlood一般在给药后的不同时间点采集血样一般在给药后的不同时间点采集血样19体内样品种类与采集体内样品种类与采集尿样尿样Urine特点：尿药浓度通常变化较大；尿药大多呈结合状态。特点：尿药浓度通常变化较大；尿药大多呈结合状态。优点：易得，且样品量多；正常尿液仅含微量蛋白。优点：易得，且样品量多；正常尿液仅含微量蛋白。缺点：尿液是一种良好的细菌培养基；尿液中多具有缺点：尿液是一种良好的细菌培养基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。紫外吸收的化合物。一般在给药后的不同时间段收集尿样一般在给药后的不同时间段收集尿样20体内样品种类与采集体内样品种类与采集唾液唾
17、液Saliva优点：非伤害性采样，且不受时间地优点：非伤害性采样，且不受时间地 点限制。点限制。缺点缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓；：唾液药浓一般低于血浆药浓；某些药物的唾液药浓（某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓）与血浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相关系数不明确；）十分接近，但两者相关系数不明确；pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药物浓度中的药物浓度。一般自然采集或刺激采集，量少一般自然采集或刺激采集，量少21体内样品的种类与采集体内样品的种类与采集组织组织tissue指各种体内脏器，需要对其进行指各种体内脏器，需要对其进行均匀化制备均匀化
18、制备，使之成匀，使之成匀浆溶液浆溶液反应药物在脏器的分布与蓄积情况反应药物在脏器的分布与蓄积情况头发头发hair取样方便，可以获得长期的用药史信息取样方便，可以获得长期的用药史信息前处理复杂，需要前处理复杂，需要排除头发表面的各种干扰排除头发表面的各种干扰222.2 体内样品贮存与处理体内样品贮存与处理室温放置时间室温放置时间短期保存温度与时间短期保存温度与时间长期保存温度与时间长期保存温度与时间-20、-40、-80分装保存分装保存便于测定便于测定去活性保存去活性保存防止酶降解防止酶降解保存温度与时间由什么决定？2.体内样品的种类、采集与贮存23研究维生素研究维生素C泡腾片进入人体后血药浓度
19、泡腾片进入人体后血药浓度-时间时间曲线变化，通过测定给药后人血浆中维生素曲线变化，通过测定给药后人血浆中维生素C实现。问：实现。问：采集血样之后如何保存？采集血样之后如何保存？维生素维生素C的的性质？性质？维生素维生素C容易氧化，因此采集容易氧化，因此采集血样后血样后加入抗氧剂保存。243.1 体内药物分析的一般流程体内药物分析的一般流程 n血样血样n尿液尿液n唾液唾液n胆汁胆汁n组织器官组织器官前处理方法前处理方法 n分离分离n纯化纯化n浓集浓集样品测定样品测定n方法建立方法建立n方法优化方法优化方法学研究方法学研究n灵敏度灵敏度n准确度准确度n精密度精密度n线性和范围线性和范围n耐用性耐用
20、性n灵敏、准确、快速、简便灵敏、准确、快速、简便3.体内药物分析方法的建立与评价25新药临床药物代谢动力学评价新药临床药物代谢动力学评价新药新药I期临床试验期临床试验阶段中进行药物在阶段中进行药物在健康志愿者健康志愿者体内药物代谢动力学，探讨药物在体内吸收、体内药物代谢动力学，探讨药物在体内吸收、分布和消除的特点，为分布和消除的特点，为II期临床实验的给药方案期临床实验的给药方案制定提供伦理依据。制定提供伦理依据。研究内容包括健康受试者研究内容包括健康受试者单次与多次给药单次与多次给药的药的药物代谢动力学研究、饮食的影响、物代谢动力学研究、饮食的影响、代谢产物代谢产物的的代谢动力学研究、代谢动
21、力学研究、药物药物-药物的代谢动力学相互药物的代谢动力学相互作用作用研究等。研究等。体内药物分析体内药物分析方法是关键方法是关键26人人血浆中普卢利沙星活性代谢产物血浆中普卢利沙星活性代谢产物NM394的检测的检测羧基：酸性羧基：酸性基团基团哌嗪环：碱性、哌嗪环：碱性、水溶性增加水溶性增加共轭结构共轭结构27分析方法建立分析方法建立分析待测物分析待测物NM394分析目标分析目标建立分析方法可以专属、灵敏、准确建立分析方法可以专属、灵敏、准确的检测出血浆中的检测出血浆中NM394HPLC法法分离分析分离分析选择内标化合物选择内标化合物准确定量准确定量选择前处理方法选择前处理方法消除干扰、提高检测
22、浓度消除干扰、提高检测浓度28分析方法的建立分析方法的建立色谱条件及优化色谱条件及优化体外方法的建立体外方法的建立色谱柱：色谱柱：Diamonsil C18 柱柱(5 m,200mm4.6mm i.d.)保护柱：保护柱：DiamonsilTM ODS 流动相：流动相：乙腈乙腈-0.5%三乙胺（磷酸调三乙胺（磷酸调pH3.0）为为21:79流速：流速：1 ml/min荧光检测：荧光检测：ex-280 nm,em-425 nm柱温：柱温：30 内标化合物为内标化合物为洛美沙星（结构类似、性质相近）洛美沙星（结构类似、性质相近）29分析方法的建立分析方法的建立样品前处理样品前处理分析方法的优化必须考
23、虑分析方法的优化必须考虑生物样品的前处理的影响生物样品的前处理的影响303.2体内分析样品前处理体内分析样品前处理3.2.1 生物生物样品前处理的目的样品前处理的目的 纯化药物，消除干扰纯化药物，消除干扰 净化净化 满足检测灵敏度的要求满足检测灵敏度的要求 富集富集 减少对分析仪器的污染减少对分析仪器的污染 改善分析改善分析环境环境除非生物样品基质不会干扰检测，也不会污除非生物样品基质不会干扰检测，也不会污染仪器，同时还有较好的灵敏度染仪器，同时还有较好的灵敏度3.体内药物分析方法的建立与评价31示例：血液中酒精的检测（直接测定）示例：血液中酒精的检测（直接测定）顶空气相色谱火焰离子化检测器进
24、行检测顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测0.2ml全血和全血和0.5ml内标放到小瓶后迅速封口内标放到小瓶后迅速封口小瓶被放到顶空进样器上小瓶被放到顶空进样器上自动加热获得气液两相平衡自动加热获得气液两相平衡将液上气体注入将液上气体注入GC分析分析323.2.2蛋白蛋白沉淀沉淀 protein precipitation PPT 测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出来来有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈）有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈）中性盐析法（饱和硫酸铵）中性盐析法（饱和硫酸铵）强酸沉淀法（高氯酸）强酸沉淀法（高氯酸）使蛋白变性后除去使蛋白变性后除
25、去33蛋白沉淀过程示意图蛋白沉淀过程示意图ABCDA 血浆样品血浆样品200lB 加入甲醇加入甲醇600lC 涡旋混合涡旋混合3min后后D 10000 rpm离心离心10min后后3434沉淀剂沉淀剂每每1容积血浆加入沉淀剂容积容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.0甲醇甲醇17.673.498.798.999.2乙腈乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐钨酸盐-硫酸硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和饱和)硫酸铵硫酸铵21.353.498.3*CuSO4-Na2WO436.597.599.9
26、100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定：样品浑浊，妨碍准确测定35蛋白沉淀应用特点蛋白沉淀应用特点确定沉淀剂与血浆的最佳比例确定沉淀剂与血浆的最佳比例稀释倍数满足检测灵敏度的要求稀释倍数满足检测灵敏度的要求尽可能多沉淀蛋白，减少对仪器的污染尽可能多沉淀蛋白，减少对仪器的污染适合适合浓度较高浓度较高的血样的血样处理过程快速处理过程快速，适合不稳定的药物测定，适合不稳定的药物测定363.2.3液液萃取液液萃取 liquid-liquid extractio
27、n LLE常选择常选择与水不混溶与水不混溶的有机溶剂，根据药物在的有机溶剂，根据药物在水中与有机溶剂中的水中与有机溶剂中的溶解度不同溶解度不同而将目标药而将目标药物和干扰物质分开，随后物和干扰物质分开，随后浓缩含有目标药物浓缩含有目标药物的有机层的有机层37液液萃取示意图液液萃取示意图取取1ml血浆血浆置具塞玻璃离置具塞玻璃离心管中心管中精密加入精密加入5ml乙酸乙酯乙酸乙酯提取溶剂提取溶剂充分涡旋混合充分涡旋混合3min38液液萃取示意图液液萃取示意图4000 rpm离心离心10min后后准确取出准确取出上层上层有机溶剂有机溶剂置另置另一干净具塞玻一干净具塞玻璃离心管璃离心管1.置置N2下水
28、浴挥干溶剂下水浴挥干溶剂2.残留物用流动相溶解残留物用流动相溶解3.离心后进样离心后进样HPLC分析分析便于纯化与富集便于纯化与富集39液液萃取应用特点液液萃取应用特点确定合适的萃取溶剂确定合适的萃取溶剂依据相似相溶原则依据相似相溶原则正正己烷己烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 正丁醇正丁醇极性增大极性增大有机相有机相:水相水相=1:15:140示例：尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测（液示例：尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测（液液萃取）液萃取）取尿液取尿液2ml，置于，置于5ml离心管中，离心管中，加入加入5ml 乙醚乙醚，涡旋，涡旋，离心，取乙醚层置另一离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，离心管中
29、，60度水浴氮气流度水浴氮气流下挥干下挥干取尿液取尿液2ml，置于，置于5ml离心管中，离心管中，加入加入100l 0.1mol/l NaOH，混匀后加入混匀后加入5ml 乙醚乙醚，涡旋，离心，取乙醚层，涡旋，离心，取乙醚层置另一置另一5ml离心管中，离心管中，60度水浴氮气流下挥干度水浴氮气流下挥干CH3HNCH3CH3NH2甲基苯丙胺（冰毒）甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺苯丙胺41液液萃取应用特点液液萃取应用特点调节水相调节水相pH值值水相水相pH值主要由药物的值主要由药物的pKa确定确定碱性药物碱性药物最佳最佳pH值要高于值要高于pKa值值1-2个个pH单位单位酸性药物酸性药物则要低则要低1-
30、2个个pH单位单位pKa 9.9pKa 10.1酸化：酸化：0.1mol/l HCl碱化：碱化：0.1mol/l NaOHCH3HNCH3CH3NH2423.2.4.固相萃取固相萃取 solid-phase extraction SPE 根据根据色谱理论色谱理论发展的一种前处理方式发展的一种前处理方式将具有吸附、分配或离子交换性质的担体作将具有吸附、分配或离子交换性质的担体作为萃取剂填入小柱，溶剂淋洗活化后，将生为萃取剂填入小柱，溶剂淋洗活化后，将生物样品通过小柱，使其药物或杂质保留在担物样品通过小柱，使其药物或杂质保留在担体上，选择一种溶剂洗去杂质，再用适当溶体上，选择一种溶剂洗去杂质，再用
31、适当溶剂将药物洗脱下来。剂将药物洗脱下来。常用担体：疏水性的常用担体：疏水性的C18化学键合硅胶等化学键合硅胶等43固相萃取基本操作固相萃取基本操作固定相固定相 C18C18先甲醇润湿小柱先甲醇润湿小柱再用水除去多余甲醇再用水除去多余甲醇1)1)活化活化44固相萃取基本操作固相萃取基本操作1)活化活化2)上样上样液体样品液体样品内源性物质内源性物质其他外源性物质其他外源性物质待测药物待测药物45固相萃取基本操作固相萃取基本操作1)活化活化2)上样上样3)淋洗淋洗选择不同极性溶剂选择不同极性溶剂依次为：水，由低依次为：水，由低到高比例的甲醇到高比例的甲醇内源性物质内源性物质其他外源性物质其他外源
32、性物质待测药物待测药物淋洗溶剂淋洗溶剂46固相萃取基本操作固相萃取基本操作1)活化活化2)上样上样3)淋洗淋洗淋洗的目的：除去淋洗的目的：除去生物样品的干扰，生物样品的干扰，待测药物仍然保留待测药物仍然保留在在SPESPE柱上柱上内源性物质内源性物质其他外源性物质其他外源性物质待测药物待测药物淋洗溶剂淋洗溶剂47固相萃取基本操作固相萃取基本操作1)活化活化2)上样上样3)淋洗淋洗4)洗脱洗脱100%100%甲醇为洗脱剂甲醇为洗脱剂内源性物质内源性物质其他外源性物质其他外源性物质待测药物待测药物淋洗溶剂淋洗溶剂洗脱溶剂洗脱溶剂48固相萃取基本操作固相萃取基本操作收集洗脱液，其中收集洗脱液，其中含
33、有待测药物含有待测药物直接进样分析直接进样分析浓缩后进样分析浓缩后进样分析待测药物待测药物洗脱溶剂洗脱溶剂1)活化活化2)上样上样3)淋洗淋洗4)洗脱洗脱49固相萃取基本操作固相萃取基本操作内源性物质内源性物质其他外源性物质其他外源性物质待测药物待测药物淋洗溶剂淋洗溶剂洗脱溶剂洗脱溶剂活化活化上样上样淋洗淋洗洗脱洗脱50固相萃取应用特点固相萃取应用特点根据根据药物性质药物性质选择适合的选择适合的柱填料柱填料，以提高提取，以提高提取回收率回收率处理速度快，具有一定通量，较容易处理速度快，具有一定通量，较容易自动化自动化或或联用联用513.2.5 其他处理方式其他处理方式固体样品固体样品均匀化均匀
34、化处理处理组织样品组织样品按照按照1:4(w/v)用生理盐水或缓冲液进行匀用生理盐水或缓冲液进行匀浆，匀浆前剪碎组织浆，匀浆前剪碎组织粪便样品粪便样品低温烘干后，取样品研碎，用适当溶剂低温烘干后，取样品研碎，用适当溶剂萃取（超声）萃取（超声）注意保证注意保证取样均一取样均一52523.2.5 其他处理方式其他处理方式缀合物的水解缀合物的水解药物或者其代谢产物与体内内源性物质结合生成的产药物或者其代谢产物与体内内源性物质结合生成的产物称为缀合物。常见物称为缀合物。常见葡萄糖醛酸苷缀合物葡萄糖醛酸苷缀合物和和硫酸酯缀硫酸酯缀合物合物缀合物较原型药物缀合物较原型药物具有较大的极性，有机溶剂不易提具有
35、较大的极性，有机溶剂不易提取。取。常用常用酸水解、酶水解酸水解、酶水解的方法使药物释放出的方法使药物释放出53血浆中血浆中NM394的样品前处理的样品前处理液液萃取液液萃取：有一定水溶性，：有一定水溶性，提取溶剂中需要加入一些提取溶剂中需要加入一些极性溶剂极性溶剂蛋白沉淀蛋白沉淀：完全可以：完全可以固相萃取固相萃取：完全可以：完全可以本实验研究本实验研究选择蛋白沉淀选择蛋白沉淀为前处理方法：为前处理方法：200l血浆血浆+50 l内标溶液内标溶液+100 l 10%高氯酸溶液高氯酸溶液涡旋混匀涡旋混匀3min 10000rpm离心离心10min 上清液取出二次离心上清液取出二次离心10000r
36、pm 10min 上清液上清液20 l进样进样HPLC分析分析考察不同蛋白沉淀剂对方法专属性的影响，和对绝对回收率的影响决定的检测灵敏度543.3体内样品分析方法学验证体内样品分析方法学验证特异性特异性标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围定量下限定量下限精密度与准确度精密度与准确度稳定性稳定性提取回收率提取回收率分析过程质量控制分析过程质量控制超限样品处理超限样品处理3.体内药物分析方法的建立与评价专属性专属性标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围定量限定量限/检测限检测限精密度与准确度精密度与准确度耐用性耐用性质量标准质量标准分析方法分析方法验证内容验证内容体内样品分体内样品分析方法学验析方法
37、学验证内容证内容55血浆中血浆中NM394检测的特异性检测的特异性内标内标NM394NM394内源性物质是否有干扰内源性物质是否有干扰未知代谢物是否有干扰未知代谢物是否有干扰与色谱分析方法有关与色谱分析方法有关与前处理方法有关与前处理方法有关56血浆中血浆中NM394检测的提取回收率检测的提取回收率提取回收率又叫绝对回收率，指从生物样品中回收提取回收率又叫绝对回收率，指从生物样品中回收得到待测物的得到待测物的响应值响应值与标准物质产生的与标准物质产生的响应值响应值的比的比值。值。180l血浆血浆+20 l 1 g/ml对照品溶液对照品溶液=200 l 标准添加血浆标准添加血浆 0.1 g/ml
38、 前处理：前处理：+50 l内标溶液内标溶液+100 l 10%高氯酸溶液沉淀高氯酸溶液沉淀浓度浓度0.1*0.2/0.35分子上的响应值分子上的响应值流动相流动相配制浓度为配制浓度为0.1*0.2/0.35的对照品溶液的对照品溶液分母上的响应值分母上的响应值57血浆中血浆中NM394检测的提取回收率检测的提取回收率评价分析方法将体内样品中的待测物从生物基质中评价分析方法将体内样品中的待测物从生物基质中提取出来的能力提取出来的能力提取回收率高，检测灵敏度就高提取回收率高，检测灵敏度就高要求在不同浓度上，具有较为接近的提取回收率即要求在不同浓度上，具有较为接近的提取回收率即可可测定浓度测定浓度
39、g/ml提取回收率提取回收率0.0278.30.1081.50.8084.358血浆中血浆中NM394的线性范围、定量下限的线性范围、定量下限采用内标工作曲线法定量采用内标工作曲线法定量配制血浆标准曲线系列浓度样品配制血浆标准曲线系列浓度样品（标准曲线样品（标准曲线样品也是经过前处理之后才能进样分析的，这与体外也是经过前处理之后才能进样分析的，这与体外质量标准完全不同）质量标准完全不同）0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50,1.00 g/ml 范围由预实验确定，范围由预实验确定，定量下限定量下限需要满足准确测定出需要满足准确测定出药物经过药物经过35个半衰期后体内浓度；或
40、者药物达峰个半衰期后体内浓度；或者药物达峰浓度的浓度的1/101/20。定量上限定量上限应高于达峰浓度。应高于达峰浓度。较较宽宽的工作曲线范围。的工作曲线范围。59血浆中血浆中NM394的线性范围、定量下限的线性范围、定量下限定量下限浓度定量下限浓度g/ml内标内标NM394比值比值0.01234882.65801.60.02470.012334505532.10.0236970.01246342.85205.90.0211330.01235620.25320.10.0225790.0122145051220.023129y=2.3051x-0.0062 定量下限浓度一般较低，因定量下限浓度一
41、般较低，因此该浓度点的准确度、精密此该浓度点的准确度、精密度也是需要考察的内容度也是需要考察的内容60血浆中血浆中NM394测定的准确度和精密度测定的准确度和精密度生物样品的处理过程非常复杂，随着前处理步骤生物样品的处理过程非常复杂，随着前处理步骤的增多，测定的准确度、精密度都会变差。的增多，测定的准确度、精密度都会变差。准确度准确度85115%，RSD15%。定量下限准确度定量下限准确度80%120%，RSD20%61血浆中血浆中NM394测定的稳定性测定的稳定性含药生物样品需要从临床或动物实验室转移至分析实验室含药生物样品需要从临床或动物实验室转移至分析实验室进行测定，需要时间；样品量巨大
42、，一天无法完成，需要进行测定，需要时间；样品量巨大，一天无法完成，需要多日完成。多日完成。短期稳定性短期稳定性室温放置的生物样品室温放置的生物样品长期稳定性长期稳定性冷冻条件下放置冷冻条件下放置自动进样器稳定性自动进样器稳定性处理后的生物样品放置处理后的生物样品放置冻融稳定性冻融稳定性涉及到生物样品复测的反复冻融涉及到生物样品复测的反复冻融62分析过程的质量控制分析过程的质量控制QC（quality control）质量控制）质量控制QC样品即在样品即在空白生物样品中空白生物样品中+已知待测物的已知待测物的对照品对照品制得，用于进行分析方法的验证和评制得，用于进行分析方法的验证和评价，以及监测每一批分析过程的完整性和正价，以及监测每一批分析过程的完整性和正确性。确性。随行标准曲线随行标准曲线定量本批次样品定量本批次样品QC样品的准确度样品的准确度确定本批次方法是否准确确定本批次方法是否准确63药时曲线药时曲线64小结小结1.概述概述2.常用体内样品的种类、采集与贮藏常用体内样品的种类、采集与贮藏体内样品的种类与采集体内样品的种类与采集体内样品的贮存与处理体内样品的贮存与处理3.体内药物分析方法的建立与评价体内药物分析方法的建立与评价体内药物分析的一般流程体内药物分析的一般流程体内分析样品前处理体内分析样品前处理 体内样品分析方法学验证体内样品分析方法学验证
